一株海洋光合細菌D25的分離與鑒定

摘要：從威海近海采得的海洋沉積物中經過富集培養和分離篩選，得到一株紫色菌落的海洋光合細菌，編號為Ｄ２５。利用梅里埃公司細菌鑒定系統對菌株的生理生化特征進行了檢測，ＡＰＩ ２０Ｅ檢測結果共有ＡＤＨ、ＣＩＴ等４項檢測項目呈陽性，ＯＮＰＧ、ＬＤＣ等１６項檢測項目呈陰性。經ＰＣＲ反應得到１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列測定和分析結果顯示該菌株為嗜硫小紅卵菌 （Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）。

關鍵詞：海洋；光合細菌；１６Ｓ ｒＲＮＡ基因；生理生化

中圖分類號：Ｑ９３－３３１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）16－3276-03

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｄ２５

ＬＩＵ Ｔｉａｎ－ｈｕａ，ＬＩ Ｌｅ－ｌｅ，ＱＩＡＯ Ｍｅｎｇ，ＸＩＥ Ｆｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｔ Ｗｅｉｈａｉ，Ｗｅｉｈａｉ ２６４２０９， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｐｕｒｐｌｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｎｕｍｂｅｒｅｄ Ｄ２５ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ＷｅｉＨａｉ ｏｆｆｓｈｏｒｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎ． Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｄ２５ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｎｅｗ ＡＴＢ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＡＰＩ ２０Ｅ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ４ ｉｔｅｍｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｕｃｈ ａｓ ＡＤＨ ａｎｄ ＣＩＴ ，１６ ｉｔｅｍｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｋｅ ＯＮＰＧ ａｎｄ ＬＤＣ． Ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆied ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ａｓ Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｒｉｎｅ； ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ

光合細菌（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＰＳＢ），是一類在自然界中廣泛存在的，能在厭氧條件下進行不放氧的光合作用并且能夠利用光能自養生長，具有復雜代謝功能的細菌的總稱。其具有固碳、固氮、脫氮、氧化硫化物等功能，是生命演化中的過渡類型，可作為光合作用機理和產氫固氮機理的研究材料［１－３］。由于光合細菌可以廣泛利用多種有機物，具有在不同的條件下進行多種方式的生長代謝的特點，使其在有機廢水處理中得以應用，和傳統活性污泥法相比，利用光合細菌處理污水具有動力消耗低、脫氮除磷效果好、設備規模小、占地面積小、管理簡易等明顯優勢［１］。此外，由于光合細菌具有凈化水質和保護水環境的作用，加之其本身是活蛋白，營養豐富，在水產養殖方面可以促進生長，提高成活率和養殖效果，含有的抗病毒因子及多種免疫促進因子可活化機體的免疫系統，因此其在水產養殖方面也得到了廣泛的應用［４］。對海洋沉積物中的一株光合細菌Ｄ２５進行分離并對其生理生化特性進行研究以及１６ＳｒＲＮＡ 基因序列的測定和分析，經鑒定該菌株為Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１海洋沉積物海洋沉積物由威海近海海域采得。

１．１．２培養基富集培養基：氯化銨１.0 ｇ，乙酸鈉２.0 ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２ ｇ，酵母膏０．２ ｇ，蛋白胨０．２ ｇ， ＥＤＴＡ １.0 ｇ，１ ０００ ｍＬ陳海水，ｐＨ值為７，滅菌后加入碳酸氫鈉１.0 ｇ， 磷酸二氫鉀０．２ ｇ。分離培養基：蛋白胨５.00 ｇ，酵母粉１.00 ｇ，檸檬酸鐵０．０１ ｇ，瓊脂１８.00 ｇ，陳海水１ ０００ ｍＬ，pＨ值為７。

１．２方法

１．２．１海洋光合細菌的富集取海洋沉積物約３ ｇ，置于盛滿富集培養基的２５０ ｍＬ密閉富集培養瓶中，置于有恒定光源（２５Ｗ白熾燈泡）的恒溫培養箱中在２８ ℃條件下富集培養３０ ｄ，至培養液呈紅褐色時，富集結束。

１．２．２海洋光合細菌的分離對富集得到的培養液進行適當稀釋后采用涂布法轉接到分離培養基，恒溫培養箱中２８ ℃恒溫培養５ ｄ。選取紫色單菌落進行進一步的分離純化培養，得到海洋光合細菌的純培養菌株Ｄ２５。

１．２．３生理生化特性檢測取一環分離純化得到的純培養菌株，通過劃線的方法轉接入分離培養基中２８ ℃恒溫培養４８ ｈ。利用梅里埃公司細菌鑒定系統（ＡＰＩ ２０Ｅ鑒定試劑條）對菌株進行生理生化特征的檢測與分析。

１．２．４１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列測定和分析［５－８］ 將菌株轉接入分離培養基中于恒定光源的恒溫培養箱中２８ ℃培養過夜。取一環單菌落懸浮于５０ μＬ無菌去離子水中，１００ ℃水浴加熱５ ｍｉｎ，離心，取上清液作為ＰＣＲ模板ＤＮＡ。擴增正向引物２７Ｆ對應于Ｅ． ｃｏｉｌ １６ＳｒＤＮＡ序列的第８～２７個堿基位置，反向引物１４９２Ｒ對應于Ｅ． ｃｏｌｉ １６ＳｒＤＮＡ的第１４９２～１５１０個堿基位置，其序列分別為５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ（Ｃ／Ａ）ＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′和５′－ＴＡＣＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡ

ＣＧＡＣＴＴ－３′。１０２．１０ μＬ ＰＣＲ反應體系組成為：１×ＰＣＲ緩沖液，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２，４×ｄＮＴＰ混合物各２００ μｍｏｌ／Ｌ，引物各０．５ μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶

１ μＬ（５ Ｕ／μＬ），２ μＬＤＮＡ 原液。ＰＣＲ反應條件為：９６ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５０ ℃復性1 ｍｉｎ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，３０個循環；最后７２ ℃ 溫育７ ｍｉｎ。ＰＣＲ擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，交由北京三博遠志生物有限責任公司進行序列測定。

向ＧｅｎＢａｎｋ提交測得的基因序列，取得收錄號。通過ＮＣＢＩ網站選取相似程度較高的序列利用ＭＥＧＡ（４．１）軟件對其進行序列比較及系統發育分析，確定其種屬及進化位置。

２結果與分析

２．１海洋光合細菌的分離篩選結果

通過富集培養，３０ d后觀察到富集培養液變為紅褐色，將富集培養液稀釋，涂布于分離培養基，經過培養后再次劃線分離得到1株純培養光合細菌，編號為Ｄ２５。

在分離培養基上，２８ ℃恒溫培養７２ ｈ，可觀察到紫色、直徑０．５～０．８ ｍｍ圓形、表面隆起、邊緣整齊、不透明的菌落。經革蘭氏染色鑒定其為革蘭氏陰性菌。

２．２生理生化特性檢測

利用梅里埃公司細菌鑒定系統對菌株的生理生化特征進行了檢測，ＡＰＩ ２０Ｅ檢測結果（表１）表明，共有ＡＤＨ、ＣＩＴ等４項檢測項目呈陽性，ＯＮＰＧ、ＬＤＣ等１６項檢測項目呈陰性。

２．２１６Ｓｒ ＲＮＡ基因序列測定與分析結果

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，得到的目的片段長度約為１ ５００ ｂｐ。將得到的目的片段交由北京三博遠志生物有限責任公司進行序列測定，得到核苷酸序列（圖１）。向ＧｅｎＢａｎｋ提交測得的基因序列，取得收錄號為ＨＱ２３４２９９。通過ＮＣＢＩ網站選取相似程度較高的序列，利用ＭＥＧＡ（４．１）軟件對其進行序列比較及系統發育分析，確定其種屬及進化位置。該菌株為Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的嗜硫小紅卵菌（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ），是一類能產氫的光合細菌，由此構建系統發育樹（圖２）。

３小結與討論

２０世紀６０年代日本科學家小林正泰等［９］發現光合細菌在不同營養級的微生物群生態演替的過程中起著十分重要的作用，而該過程是高濃度有機廢水在自然界得以自凈的原因所在。采用光合細菌處理污水不僅能夠降解簡單的有機化合物，而且還能夠降解較難處理的芳香化合物和鹵代化合物，因此光合細菌處理污水具有較大的推廣應用價值［１］。隨著對光合細菌研究的深入，光合細菌作為一種具有特殊營養、促生長、抗病因子和高效率凈化養殖污水及對環境和水產動物無毒無害的特殊細菌［４］，在水產養殖等領域中被逐漸得到了應用。

試驗從海洋沉積物中分離篩選得到了海洋光合細菌Ｄ２５，通過ＰＣＲ技術擴增得到其１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，經測序和比對，將其鑒定為Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ，由此構建系統發育樹，確定了其親緣進化關系。嗜硫小紅卵菌是一種能利用還原性硫化物作為光合電子供體營光自養生長的嗜鹽紫色非硫細菌，這種代謝的方式對凈化海水、海產養殖地和高鹽含硫廢水的生物治理將具有重要意義。其菌體含有較為豐富的蛋白質和色素，可作為魚類的開口飼料資源的重要來源，此外用其來培育輪蟲等多種餌料生物，其所含有的營養物質可以通過食物鏈的關系間接供給水產養殖動物［１０］，因此菌株Ｄ２５在水產養殖方面也有著廣泛的利用價值。

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