改良CTAB法提取大戟屬藥用植物葉片總DＮA試驗

摘要：由于大戟屬（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Ｌｉｎｎ）植物葉片中含大量的多糖、酚類等次生代謝物質，嚴重影響總ＤＮＡ的提取，因此，以大戟屬藥用植物葉片為材料，對常用的ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法進行了改良，并通過瓊脂凝膠電泳法對所提ＤＮＡ樣品進行了檢測。結果表明，改良ＣＴＡＢ法提取的植物總ＤＮＡ純度很高，較適合提取大戟屬植物的總ＤＮＡ。

關鍵詞：大戟屬；藥用植物；ＣＴＡＢ法；總ＤＮＡ提取

中圖分類號：Ｑ９４９．７５３．５；Ｑ５０３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）16－3418-03

Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｈｅｒｂ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Linn

ＷＥＩ Ｓｈｅｎｇ－ｈｕａ，ＭＥＮＧ Ｎａ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａｎｈｕｉ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈｕ ２４１０００，Ａｎｈｕｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ in Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Ｌｉｎｎ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｒｉｃｈ ｉｎ ａｍｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ． Ｔｈｅｓｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ provided some ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔs oｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， ｔｈｅ ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ） ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍｅａｎs ｏｆ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ suitable ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ of its’ ＤＮＡ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ａ ｇｏｏｄｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Ｌｉｎｎ； ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｈｅｒｂ； hｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（CTAB） ｍｅｔｈｏｄ； ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

ＤＮＡ的提取與純化是進行分子標記試驗最關鍵的一步，獲得高質量的ＤＮＡ樣品是進行ＰＣＲ擴增的首要步驟［１］。從植物材料中提取基因組ＤＮＡ的質量受到多種因素的影響，在不同植物或同種植物不同時期組織中存在著不同數量的多糖、色素以及種類繁多的次生物質，特別是多糖、酚類在提取過程中可與ＤＮＡ產生沉淀，形成包裹ＤＮＡ的黏稠膠狀物，其難以溶解或產生褐變，使得ＤＮＡ提取質量較低，獲得的ＤＮＡ溶液常常黏度大乃至呈膠狀，這些物質如果清除不凈則會影響后續的試驗研究［２－４］。大戟屬（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ Ｌｉｎｎ）為大戟科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅｃ）植物中最大的一屬，全世界有２ ０００余種［5］，其中不少種具有很高的藥用價值，李忠國［６］調查發現，安徽省瑯琊山藥用植物資源中有２２種大戟科藥用植物；李惠等［７］通過研究華東地區大戟屬藥用植物資源后，整理出了２６種大戟屬藥用植物，并且藥用部位明確，療效確切，具有較高的藥用價值。大戟屬藥用植物的醫藥價值使得其研究開發成為了熱點，尤其是對大戟屬藥用植物在分子水平上的探討方興未艾。目前在大戟屬藥用植物進行分子標記試驗中，由于本屬植物具有白色或黃白色乳汁，含酚類、黃酮類等次生物質較多，若提取方法不當，不僅提取出來的ＤＮＡ容易降解，而且會影響ＰＣＲ擴增反應的穩定性和重復性。因此，如何高效簡便地去除多糖、多酚等次生物質，對提取純化大戟屬植物ＤＮＡ至關重要。目前，大戟屬藥用植物總ＤＮＡ提取方法的研究在國內外尚未見報道，所以在前期研究的基礎上［８，９］，結合本屬植物特點，以經典提取植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ（十六烷基三乙基溴化銨，Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法為基礎［１０］，并加以改進，篩選出一種比較適合大戟屬植物ＤＮＡ提取的方法，為大戟屬藥用植物進一步開發利用提供技術支持。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１供試材料試驗所用植物材料為采自安徽省瑯琊山的大戟（Ｅ． ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ Ｒｕｐｒ．）、月腺大戟

（Ｅ． ｅｂｒａｃｔｅｏｌａｔａ Ｈａｙａｔａ）；采自蕪湖市的乳漿大戟（Ｅ． ｅｓｕｌａ Ｌ．）、斑地錦（Ｅ． ｓｕｐｉｎａ Ｒａｆｉｎ）、地錦（Ｅ． ｈｕｍｉｆｕｓａ Ｗｉｌｌｄ．）、一品紅（Ｅ． ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ Ｗｉｌｌｄ． ｅｔ Ｋｌｏｔｚｓｃｈ．），原植物均經安徽師范大學周守標教授鑒定。用于提取ＤＮＡ的材料為各供試植物的新鮮葉片，采后迅速置于冰盒中，帶回實驗室后，除去主葉脈，在電子天平上精確稱取０．５ ｇ，于－２０ ℃冰箱保存３ ｄ。

１．１．２主要試劑①ＤＮＡ抽提緩沖液，ＮａＣｌ ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １００ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０和ＥＤＴＡ ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０。②ＤＮＡ裂解緩沖液，ＮａＣｌ ７００ ｍｍｏｌ／Ｌ， Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ、 ｐＨ值８．０和

ＥＤＴＡ ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０，ＣＴＡＢ ５％（m/V），β－巰基乙醇１％（用前加）［１１］。③ＴＥ緩沖液，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０和ＥＤＴＡ １ ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０。④５０×ＴＡＥ緩沖液，Ｔｒｉｓ ２４２ ｇ，冰乙酸５７．１ ｍＬ，ＥＤＴＡ（０．５ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０）１００ ｍＬ。⑤氯仿－異戊醇混合液（體積比為２４∶１，下同）。配制藥品用的水均為雙蒸餾水。將以上緩沖液分裝后，密封、滅菌，置于冰箱４℃保存。

１．１．３主要儀器試驗中的主要儀器有凝膠成像儀、微波爐、離心機、超低溫冰箱、電泳槽、電泳儀、手掌型離心機、恒溫水浴鍋、電熱恒溫鼓風干燥箱、超凈工作臺等。

１．２方法

１．２．１改良ＣＴＡＢ法提取植物總ＤＮＡ①提取前將裂解緩沖液放至６５ ℃水浴中。②稱取０．５ ｇ植物材料，用液氮速凍后，迅速研磨成細粉，分裝于１．５ ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。③在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中加入１ ｍＬ ＤＮＡ提取緩沖液，用力搖動使其充分混勻后，于１５ ℃、８ ０００ ｇ離心５ ｍｉｎ。④靜止后棄上清，再加入１ ｍＬ ＤＮＡ提取緩沖液，充分混勻，于１５ ℃、

８ ０００ ｇ離心５ ｍｉｎ。⑤靜止后棄上清，加入１ ｍＬ ６５ ℃預熱的ＤＮＡ提取緩沖液，懸浮沉淀，充分混勻，放入６５ ℃水浴３０ ｍｉｎ。⑥于１５ ℃、１２ ０００ ｇ離心５ ｍｉｎ，取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻，靜置１０ ｍｉｎ。⑦于１５ ℃、１２ ０００ ｇ離心５ ｍｉｎ，取上清，加入等體積的異丙醇，充分混勻，４ ℃靜置３０ ｍｉｎ 。⑧于１５ ℃、１２ ０００ ｇ離心１０ ｍｉｎ，靜止后棄上清，加入７５ ％（V/V）乙醇洗數次。⑨于１５ ℃、１２ ０００ ｇ離心３ ｍｉｎ，靜止后棄上清，自然風干直至無酒精味。⑩加入１００ μＬ ＴＥ緩沖液，放入４ ℃環境待用，或－２０ ℃儲存。

１．２．２電泳檢測對所提取的ＤＮＡ取３～５ μＬ于０．８％的瓊脂糖凝膠上，以５ V／ｃｍ電泳１ ｈ左右，ＥＢ染色２０～２５ ｍｉｎ，在凝膠成像系統（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ）中觀察和拍照。

２結果與分析

２．１ＤＮＡ電泳結果

將葉片各部位提取的ＤＮＡ進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測結果見圖１。ＤＮＡ電泳結果顯示，改良ＣＴＡＢ法所提取的大戟屬植物葉片的ＤＮＡ為一條清晰完整的條帶，ＤＮＡ片段大小較一致，條帶后面沒有明顯的拖尾，證明所提葉片的總ＤＮＡ含雜質較少。

２．２總ＤＮＡ純化

加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，輕緩顛倒混勻，室溫靜置１０～１５ ｍｉｎ；于１2 ０００ ｇ離心１０ ｍｉｎ；重復前面步驟。取上清液，加入終濃度０． ２～０． ４ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＡｃ、1２倍體積的無水乙醇，放置１ ｈ。１２ ０００ ｇ離心１０ ｍｉｎ，棄上清液。用７０ ％乙醇洗滌沉淀２～３次，自然干燥后，溶于５０～１００ μＬ ＴＥ中，－２０ ℃保存備用。

３討論

雖然植物ＤＮＡ的提取是一項常規的分子生物學實驗技術，但由于大戟屬植物組織細胞中含有大量的酚類、多糖及其他次生代謝產物，使得用傳統的ＣＴＡＢ方法難以分離出高質量的ＤＮＡ，如果提取方法選擇不當，會干擾后續的操作。作者對大戟屬植物葉片總ＤＮＡ的提取過程經過反復的改進，最后提取出了質量較高的總ＤＮＡ，并在提取中總結出以下操作事項，以期為大戟屬藥用植物的分子生物學研究提供技術支撐。

１）首先，用于ＤＮＡ提取的植物材料是從遠離實驗室的野外采集獲得，新鮮材料在旅途中容易枯萎、腐爛，特別是一些離體材料極易受到ＤＮＡ酶的作用，導致ＤＮＡ的降解。因此采集后必須迅速置于冰盒中，帶回實驗室。

２）植物材料在研磨時，一定要使材料處于低溫狀態，而且所用研缽應該是預先在－２０ ℃冰箱冷凍過夜、待其徹底冷卻后再放入植物材料。在研磨過程中，確保不要讓液氮揮發干凈，以防止植物材料回溫，否則會造成ＤＮＡ的嚴重降解；研磨葉片時，粉末研得越細越好，研磨好的材料非常容易變褐，宜迅速轉入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，不要使之融化，以免造成ＤＮＡ的降解。

３）在提取ＤＮＡ的過程中，所有的操作均需要動作輕柔，避免劇烈振動，以免ＤＮＡ斷裂降解。

４）在用氯仿-異戊醇混合液抽提時，離心溫度應保持不低于１５ ℃；若溫度太低，可能導致ＣＴＡＢ沉淀，從而損失ＤＮＡ；在離心前增加氯仿－異戊醇混合液和提取緩沖液的接觸時間，讓雜質更好地被分離，減少用氯仿－異戊醇混合液的抽提次數，避免操作過程中ＤＮＡ的污染。

５）ＣＴＡＢ是一種陽離子去污劑，既能有效裂解植物的細胞壁，又能去除多糖類物質，還可以溶解細胞膜，較好去除多糖的干擾。在加入ＣＴＡＢ緩沖液進行溫浴時，將時間延長至２ ｈ能更好地處理多糖、酚類及其他雜質，所獲得的ＤＮＡ質量也將較高。

６）在提取過程中，采用常規ＣＴＡＢ法常出現多酚類物質的褐化現象，使ＤＮＡ溶液顏色產生渾濁。β－巰基乙醇具有抗氧化作用，在改良ＣＴＡＢ法中，提取液中加入１％ β－巰基乙醇可以有效地去除植物組織內的多糖物質和多酚類物質，防止酚類物質造成褐化現象。

７）ＰＣＲ技術對ＤＮＡ樣品量和純度的要求均不高，但因ＰＣＲ具有很高的靈敏度，為防止試劑交叉污染，應盡量減少提取步驟；采用改良的ＣＴＡＢ法提取大戟屬植物ＤＮＡ，能夠獲得高質量的ＤＮＡ樣品。

８）在ＤＮＡ提取過程中，用異丙醇沉淀時，若異丙醇未揮發盡，會直接影響Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的活性，試驗中應該讓異丙醇沉淀離心后充分揮發。

９）在ＤＮＡ提取過程中，氯仿是蛋白的有效沉淀劑，對Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶有變性作用。

１０）ＤＮＡ沉淀出現后，絮狀沉淀不一定全是ＤＮＡ沉淀，判斷絮狀沉淀的標準是看其是否易溶于ＴＥ，若易溶則說明其雜質含量較少，若難溶則說明其雜質含量較高，純度較差。而ＴＥ溶解是一個比較緩慢的過程，為了充分溶解，通常在４℃條件下溶解１ ｄ。

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