日本薯蕷脫毒培養及離體高效快繁體系的建立

解曉紅，陳 麗，裴 蕾，李江輝，李 波，解紅娥，武宗信

（山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000）

日本薯蕷（Rhizoma Dioscoreae）為薯蕷科植物，屬多年生纏繞草本，我國除少數熱帶地區外，幾乎各地都有種植。薯蕷塊莖藥用價值很高，被醫學家稱為“理虛之要藥”，“滋補藥中的上品”。《本草綱目》認為，薯蕷能“益腎氣，健脾胃，止瀉痢，化痰涎，潤皮毛”。薯蕷營養價值豐富，富含粗蛋白、氨基酸、維生素、淀粉和糖等[1]。日本薯蕷外形粗壯，通體筆直，均勻美觀，產量高，我國每年出口到日本、韓國的干、鮮貨可達10萬t以上，而且供不應求。但由于多年的傳統種植，近年來日本薯蕷品種退化、病毒為害嚴重，表現癥狀為葉色失綠、花斑葉、葉畸形；地下塊莖明顯變小、畸形，產量下降，品質不高，嚴重時整株矮化，生長緩慢，甚至死亡。目前，大田中已發現的病毒有山藥壞死花葉病毒（Chineseyam necroticmosaicvirus）、山藥綠色斑駁病毒（Yam green-bandingvirus）、日本山藥花葉病毒（Japanese yammasaic virus）、馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y）、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf rollvirus）、馬鈴薯A病毒（Potato Virus A）、馬鈴薯 M病毒（Potato VirusM）、馬鈴薯 S病毒（Potato Virus S）和馬鈴薯X病毒（Potato Virus X）等[2-3]。目前，在無任何特效藥劑防治病毒病的情況下，利用組織培養技術建立薯蕷脫毒培養和離體高效快繁技術體系，是日本薯蕷去除病毒、恢復種性、增加產量、提高品質的最佳途徑[4-11]。

本研究通過組織培養手段對日本薯蕷進行脫毒及快繁技術研究。

1 材料和方法

1.1 供試材料

日本薯蕷植株由山西省聞喜縣中藥材種植基地提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得 切1 cm左右日本薯蕷莖段，用75%乙醇浸泡30 s，再用不同消毒劑消毒，篩選合適的消毒劑及用量。消毒莖段接種到MS附加不同激素培養基上進行培養，獲取無菌苗。

1.2.2 莖尖培養 在無菌條件下，切取日本薯蕷無菌苗0.2～0.4mm莖尖，每個莖尖帶2個葉原基，然后轉入MS附加不同外源激素的培養基中進行培養。每瓶接種1個莖尖，接30瓶。90 d后統計結果。

1.2.3 電鏡觀測法檢測脫毒莖尖苗 將待測莖尖苗汁液滴在覆膜銅網上制作樣本，電鏡觀測到病毒質粒的為帶毒苗。

1.2.4 多芽體誘導進行快繁 將莖尖形成的叢生小苗，切成帶有1個腋芽的莖段，接種到培養基上。40 d后統計多芽體數和生長狀況。

1.2.5 試管苗快繁培養 將多芽體切成單芽接種到培養基。40 d后統計苗高、葉片數、生根數。

1.2.6 試管苗移栽 薯蕷試管苗長至5～6片葉時進行移栽。

試驗中，瓊脂0.7%，pH值為6.0，光強2000～5000 lx，光照時間12h/d，培養溫度（28±1）℃。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑對無菌苗培養的影響

取自大田的外植體含有大量的雜菌，消毒后接種才能長出無菌苗。設計不同用量和消毒時間，分別使用HgCl2和NaClO對來自大田的外植體進行消毒比較試驗，結果（表1）表明，用0.1%HgCl2消毒6～8min效果好，污染率控制在20%以下，成活率達80%～90%；用0.1%HgCl2消毒時間超過10min時，因HgCl2殺傷力強，消毒后不易消除，容易殺傷植物組織，死亡率增大；用0.1%HgCl2消毒小于 6 min或用 0.05%HgCl2時，莖段苗成活率雖提高，但難以消除頑固性的雜菌，污染率會增加。用NaClO消毒，污染率較高，滅菌效果不理想。消毒好的日本薯蕷莖段苗接種到MS附加不同激素培養基上，可獲得無菌苗。

表1 消毒劑用量及消毒時間對莖段苗成活率的影響

2.2 不同外源激素對日本薯蕷莖尖存活率和芽分化的影響

選擇生長健壯的薯蕷無菌苗，在4×10 X解剖鏡下切取0.2～0.4mm莖尖，分別放入MS附加不同質量濃度6-BA，NAA，IBA培養基中，莖尖均能啟動細胞分裂，5～7 d莖尖開始膨大變綠或脫分化形成半透明顆粒狀愈傷組織，90 d后誘導出的愈傷組織再分化形成高約0.5 cm小苗（表2）。

表2 不同外源激素對莖尖分化的影響

由表2可知，（1）單一6-BA就能誘導莖尖成苗，隨6-BA質量濃度（0.25～1.0mg/L）增大，莖尖存活率和分化出芽數目增加，但較高質量濃度（1.5mg/L）反而不利于莖尖的成活和芽分化；（2）6-BA配合較高質量濃度的NAA有利于莖尖分化、長出多芽和有利于芽的生長，0.5mg/L 6-BA＋1.5mg/LNAA成苗率達到 100%；（3）在6-BA質量濃度一定的情況下，添加不同質量濃度IBA，對莖尖成苗差異不明顯，但分化出的芽生長較快，愈傷產生量較小。

2.3 電鏡觀測法檢測脫毒莖尖苗

將待測莖尖苗汁液滴在覆膜銅網上制作樣本，在電鏡觀測到病毒顆粒的為帶毒苗。去除檢測出的帶毒苗，剩余的即為脫毒苗，用于進一步的脫毒快繁。如果莖尖苗的含病毒顆粒較多，可以再次在4×10X解剖鏡下切取0.2～0.4mm莖尖，進行培養后檢測。如此重復2～3次可以使脫毒的效果提高到90%以上。

2.4 不同激素配比對薯蕷莖段快繁多芽體形成的影響

將脫毒的莖尖苗切成帶1個芽的莖段接種在不同培養基中，其均能分化成多芽或苗（表3）。

表3 不同激素配比對莖段快繁多芽體形成的影響

接種40 d后的統計結果表明，在莖段誘導多芽體形成過程中，6-BA起著主導作用。在NAA質量濃度一定的情況下，隨6-BA濃度增加，多芽體形成增多，如A，B，C培養基中，芽體平均數由4個增加到4.8個，且芽體生長健壯。在6-BA質量濃度一定時，隨NAA質量濃度增大，形成芽個體數減少，且芽偏白，不利于后期生長。如A，D，E培養基中，芽體平均數由4.0個降至1.9個。在MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA中，形成的多芽體數最多，達到4.8個，芽體呈綠色，芽體高2～4 cm；在MS＋2.0mg/LKT＋0.2 mg/LNAA中，芽體的分化率雖比較低，但芽體大，苗壯。在MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA基礎上添加IBA對誘導薯蕷多芽體形成沒有太大影響。結果表明，日本薯蕷莖段快繁多芽體誘導以MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.5mg/LNAA為佳，繁殖系數大，芽分化和生長狀態良好。

2.5 不同激素配比對薯蕷試管苗生根和生長的影響

將多芽體切成單芽，接種到生根培養基中，40 d后，所有培養基均長出嫩莖，并長出新葉，但能生根且生長勢強的只有2種培養基。在試管苗生長過程中，較低質量濃度的NAA明顯能促進生根；6-BA和NAA組合對叢生芽的形成和生長有利，而對生根的效果不明顯，且極易促進愈傷的形成，其中6-BA的存在明顯促進了芽的生長和分化；KT和NAA組合培養基中芽分化較少，但試管苗生長較好，且生根效果明顯；KT/NAA的比值越大，試管苗長勢越壯，根系發育越好，最終選擇MS＋2.0mg/L KT＋0.02mg/LNAA的效果最好；MS＋1.0mg/LKT＋0.2mg/LNAA雖然生根條數最多，但試管苗長勢不好（表4）。消毒大田莖段產生無菌苗也是接種到這2種培養基上效果較好。

表4 不同激素配比對試管苗生長和生根影響

2.6日本薯蕷試管苗的移栽

當薯蕷試管苗長至5～6片葉時進行移栽，在培養間28℃左右的條件下，打開瓶蓋，逐漸降低濕度，進行煉苗，2～3 d后洗凈試管苗根部培養基，移栽到裝有沙、蛭石、泥炭土混合基質的營養缽或移栽盤中，用800～1 000倍移栽液澆灌，并采取適當的保濕措施，移栽成活率達85.5%。同時，移栽時期以春、秋、冬三季為好，植株成活率高；夏季由于高溫高濕，細菌繁殖速度較快，容易造成污染，移栽成活率降低。

3 結論和討論

本研究得出，標準的脫毒快繁程序為：消毒的莖段在培養上產生無菌苗，切取無菌苗0.2～0.4 mm莖尖接種到MS＋0.5 mg/L 6-BA＋1.5 mg/LNAA，進行病毒檢測并剔除帶毒莖尖苗，脫毒莖段接種到MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA進行誘導多芽體快繁，多芽體分割成單芽在MS＋2.0mg/LKT＋0.02mg/LNAA上進行誘根和生長，生根的再生植株移栽到大田。

本試驗只是確定了脫毒的流程，獲得了移栽到大田的脫毒植株，在生產上的應用和表現以及推廣工作還有待于進一步研究。

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