抗絲黑穗病玉米種質資源的SSR標記遺傳多樣性分析

王艷梅 ，田 歌 ，王陸軍 ，王 燕 ，李 欣 ，趙 明

（1.山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原030032；2.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032；3.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州034000；4.山西省農業科學院現代農業研究中心，山西太原030031）

近年來，隨著科學技術的不斷發展，分子標記技術已成為玉米遺傳育種的有力工具。該技術為玉米育種、優勢類群劃分及雜種優勢模式的建立提供了分子水平上的理論依據，并且加快了選擇育種進程，同時為抗性基因的定位、克隆、轉化打下了堅實的基礎。由于SSR標記具有引物豐富、多態性高等特點，利用其進行抗病玉米種質的遺傳多樣性評價更具優勢。中國農業科學院袁力行等[1]利用4種分子標記方法（RFLP，RAPD，AFLP和SSR）研究了玉米自交系的遺傳多樣性，認為RFLP，SSR更適合玉米遺傳多樣性的研究。

本研究利用SSR標記技術，以40份絲黑穗病抗性不同的國內常用和自選玉米自交系作為試驗材料，分析其遺傳多樣性，旨在為抗玉米絲黑穗病種質資源的改良及運用、抗病自交系和雜交種的選育等育種實踐提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

選用40份對玉米絲黑穗病具有不同抗性的常用和自選玉米自交系作供試材料，其系譜及抗性列于表1。材料分為2個部分：（1）6份標準測驗種，包括黃早四，丹 340，Mo17，B73，掖 478 和齊319，依次代表唐四平頭，旅大紅骨，Lancaster，Reid，PA和 PB這6個類群；（2）34份常用和自選自交系。供試材料均經過多年自交，遺傳穩定。

表1 40份供試玉米自交系對絲黑穗病的抗性及系譜來源

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與純化 玉米種子在20～30℃暗箱培養4～5 d后，每自交系混合取10株黃化苗葉片，按CTAB法抽提、純化DNA[2-3]。

1.2.2 SSR引物篩選 由上海生物工程公司合成110對SSR引物，以供試玉米材料基因組DNA為模板，篩選出擴增條帶清晰[4]、多態性高的引物57對。

1.2.3 SSR擴增 采用20μLPCR反應體系：包括 10×buffer（含 Mg2+）2.0μL，2.5 mmol/L dNTPs1.0μL，1 U Taq DNA聚合酶，10μmol/L SSR引物1.0μL，50 ng模板DNA，滅菌無離子水。PCR反應程序為：95℃預變性5min；95℃1min，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，擴增 35 個循環；72℃延伸10min，最后在4℃保存。擴增在PTC-100上完成。

1.2.4 擴增產物檢測 擴增產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離，銀染檢測[5]，掃描記錄。

1.2.5 數據統計 依據SSR擴增檢測結果，在相同遷移位置有帶記為1，無帶記為0，缺失記為9，建立數據庫。遺傳相似系數（Genetic Similarity，GS）按照公式GS=m/（m＋n）計算，其中，m為基因型間共有帶數目，n為基因型間差異帶數目。按照UPGMA方法對供試自交系進行聚類分析。多態性信息量（PIC）按公式PIC=1－∑Pi2計算，其中，Pi表示第i個位點等位變異出現的頻率[6]。所有數據統計均由NTSYS 2.10e軟件完成。

2 結果與分析

2.1 SSR標記數據分析

本研究從110對SSR引物中篩選出擴增帶型清晰穩定的57對引物，對40份玉米絲黑穗抗性不同的自交系進行擴增，總計10 880個擴增帶，其中，76個為雙帶，3個無帶，其余99.3%以上均為單帶。57對SSR引物平均分布于玉米的10條染色體上（表2），在供試材料中共檢測到272個等位基因位點，平均每對引物檢測到4.77個。PIC變化在0.296～0.791之間（表2），平均為0.613，其中4號引物PIC最大，為0.791，46號引物的PIC最小，為0.296。

表2 57對SSR引物擴增片段在染色體的位置及對40份自交系擴增的多態性信息量

2.2 40份自交系類群劃分

根據SSR數據得出，40份玉米自交系的遺傳相似系數（GS）在0.610～0.993之間。利用NTSYS 2.10e軟件，用UPGMA方法建立聚類圖（圖1）。在GS為0.72時，40份自交系分為5大類群[7]（表3）。A群是以黃早四為代表的唐四平頭群，共4份；B群是以丹340為代表的旅大紅骨群，共6份；C群是以Mo17為代表的Lancaster群，共6份；D群是BSSS群，分為2個亞群，以B73為代表的Reid亞群，共2份，以掖478為代表的PA亞群，共6份；E群是以齊319為代表的PB群，共16份。結合分析供試自交系的系譜資料（表1），利用SSR標記劃分的類群與其種質類群具有較好的一致性。

2.3 抗絲黑穗病種質類群分析

從SSR聚類結果得出，33個抗病或中抗絲黑穗病的玉米自交系被劃分在5大類群中（表4）。其中，唐四平頭群2份中抗，2份高感；旅大紅骨群和Lancaster群均為中抗或抗；BSSS群中抗以上的種質4份，感病的種質4份；PB群中有15份中抗以上的品種，只有1份高感種質。

表3 40份玉米自交系的SSR標記聚類結果

表4 40份玉米自交系絲黑穗病抗性的類群分布

3 討論

本研究采用SSR標記，并在供試自交系中加入6大玉米種群標準測驗種，成功將40份玉米自交系聚類劃分為5大種群，其中D群含有2個亞群，劃分結果與傳統玉米自交系遺傳系譜的劃分結果[8]一致性很高，并且成功區分了BSSS的2個亞群Reid群與PA群（Ried改良）。E28與以丹340為代表的旅大紅骨群的遺傳距離較遠的關系也得到了正確體現；改65、鄭58-2、鐵7922等均劃入了正確的類群；未知材料Ty93-2被劃入了旅大紅骨群。實際上玉米育種中優良的雜交組合均產生在SSR標記聚類劃分的類群間，無一產生在類群內。例如，優良組合中單2號（Mo17×自 330）、鐵丹 9號（鐵 7922×丹 340）等組合的父母本均產生在不同的類群間，這從實踐上證明了SSR標記技術是劃分玉米自交系種群的有效工具。

供試材料中33個抗病或中抗絲黑穗病的玉米自交系分布在6個不同類群中，根據雜種優勢利用的原理，均可用于改良類群內的感病自交系和選育抗病自交系。尤其是旅大紅骨群、Lancaster群和PB群中抗病自交系較多，可以構建抗病種質群體。目前，國內外開展的玉米絲黑穗病抗源鑒定表明：抗絲黑穗病的玉米種質資源并不豐富，尚未發現絕對免疫材料。希望本研究結果能為玉米抗絲黑穗病的遺傳機制闡明、抗玉米絲黑穗病新種質和新品種的創新、增強我國玉米抗病種質創新能力提供技術儲備。

［1］ 袁力行，傅駿弊，Warburton M，等.利用 RFLP，SSR，AFLP 和RAPD標記分析玉米自交系遺傳多樣性的比較研究[J].遺傳學報，2000，27（8）：622-627.

［2］ Saghai-Maroof M A，Soliman K M，Jorgensen R A，et al.Ribosmal DNA spacer length polymorphisms in barley:Mendelian inheritance,chromosomal location and population dynamics[J].Proceeing of the National Academy of Science USA，1984，81：8018-8041.

［3］ 李藝，鐵雙貴，朱衛紅，等.快速CTAB法提取玉米種子胚基因組 DNA[J].河南農業科學，2008（2）：17-20.

［4］ 王陸軍，白建榮，王艷梅，等.山西省主推玉米雜交種純度鑒定 SSR核心引物的篩選 [J].山西農業科學，2010，38（1）：19-22.

［5］ 李新海，焦少杰，傅駿驊，等.兩種凝膠電泳系統對SSR標記多態性的影響[J].安徽農業科學，2001，16（2）：43-48.

［6］ Smith JSC，Chin ECL，Shu H，etal.An evaluation of theutility of SSR lociasmolecularmarkers inmaize（Zeamays L.）:Comparisonswith data from RFLPsand pedigree[J].Theoretical Applied Cenetic，1997，95：163-173.

［7］ 袁力行，傅駿弊，張世煌，等.利用RFLP和SSR劃分玉米自交系雜種優勢群的研究[J].作物學報，2001，27（2）：149-156.

［8］ 高潔，祁新，蔚榮海，等.對絲黑穗病不同抗性的玉米自交系的遺傳多樣性研究 [J].吉林農業大學學報，2006，28（8）：490-493.