表達譜芯片分析PPAR-α調控脂肪代謝過程作用機理的研究

侯曉亮，畢重朋

（1.東北農業大學動物營養研究所，哈爾濱 150030；2.黑龍江民族職業學院，哈爾濱 150081）

哺乳動物的脂肪代謝為三大物質代謝之一，其信號轉導途徑具有復雜而精細的調控網絡，主要參與了機體的能量供應及儲存、生物膜的構成及其他一些重要的生命過程。脂肪代謝主要包括甘油三酯（TG）代謝、膽固醇及其酯的代謝、磷脂和糖脂代謝等。

在這些代謝過程中，大量的蛋白酶、受體、轉錄因子等參與其中，又受一些信號轉導途徑的調控，形成了復雜而精細的調控網絡，以維持細胞乃至整個機體的脂代謝平衡。小腸對于飼料養分的選擇性吸收往往是被一些運輸蛋白和代謝酶類所介導的，這些物質被統稱為“腸道屏障蛋白”。其中，過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR－α）是一種在基因表達水平上調節脂肪代謝作用的重要受體，且大量富集于腸內表達。

基因芯片技術是20世紀90年代以來生命科學領域中的重大科技進步之一，是集分子生物學、化學、微電子學、計算機科學、統計學和生物信息學等諸多學科為一體的高新技術。近年來基因芯片技術不斷得到完善，并在發病機理、診斷治療、藥物篩選與研發、染色體缺陷等諸多領域顯示出了巨大的應用價值。在動物體的研究中，主要通過對小鼠、大鼠和畜禽等試驗來探索基因功能、新藥篩選、疾病的臨床診斷和檢測等。隨著基因芯片技術的廣泛應用以及相關芯片實驗數據在公共數據庫中的公布，為從基因組層面上研究轉錄因子PPAR－α調控脂肪代謝過程機理提供了理論參考。

1 試驗材料

從NCBI中的GEO數據庫搜索并獲得與小鼠脂肪代謝相關的基因芯片數據，序列號為GSE9533，芯片平臺為Affymetrix公司的小鼠全基因組Mouse 430_2芯片[1]。該系列芯片總樣本數為35個，從中選取與轉錄因子PPAR－α的激活劑WY14643相關的后8個樣本數據，包括野生型樣本4個（樣本號分別為GSM241420～GSM241423），PPAR－α 敲出型樣本4個（樣本號分別為GSM241424～GSM241427）。該芯片為分別選取純種的野生型（129S1/SvIm J）和PPAR－α敲出型（129S4/SvJae）小鼠作為試驗對象，并在其飼料中添加WY14643，飼養6 h后，分別取各組中4只小鼠小腸組織的RNA樣本，用MOE 430v2.0GeneChip?陣列標記。

2 試驗方法

2.1 顯著性差異表達

研究PPAR－α的缺失對小鼠基因組結構的改變情況，對該芯片的顯著性差異表達基因進行分析。運用RobustMultichip Averaging（RMA）算法對所選取的8個樣本數據進行背景校正和標準化操作[2]；針對Case－Control的試驗設計，利用非配對t檢驗方法比對處理組與對照組樣本基因表達量，篩選與PPAR－α轉錄因子存在著顯著性相關的基因，其中將顯著性水平閾值設為0.05（P=0.05），倍數改變值（Fold Change）設定為2。上述操作均在R程序結合Bioconductor軟件包的環境下實現的[3]。

2.2 聚類分析和通路分析

運用2×3的自組織聚類法（SOM）對上述差異表達基因進行聚類分析；為了確定所篩選出來的顯著性差異表達基因所參與的通路，采用費舍爾精確性檢驗（Fisher exact test）原理并結合KEGG數據庫及DAVID網絡數據庫工具對差顯基因進行功能注釋和通路分析[4－5]。

3 試驗結果

3.1 顯著性差異表達基因分析

通過顯著性差異表達分析，利用各基因的P值和倍數改變量得到顯著性差異表達基因數為158個，其中上調的基因有7個，下調的基因有151個。即表明與PPAR－α的缺失存在顯著性正相關的基因有7個，負相關的基因有151個。

3.2 聚類分析

通過對非配對t檢驗方法所得到的158個顯著性差異表達基因的聚類分析，可以得到6種聚類。其中，第一聚類包含23個基因，表達量值取以2為底的對數變化范圍從－1到2；第二聚類包含20個基因，表達量值取以2為底的對數變化范圍從－3到2；第三聚類包含38個基因，表達量值取以2為底的對數變化范圍從－2.5到2.5；第四聚類包含35個基因，表達量值取以2為底的對數變化范圍從－2到2；第五聚類包含21個基因，表達量值取以2為底的對數變化范圍從－3到2.5；第六聚類包含21個基因，表達量值取以2為底的對數變化范圍從－4到4.5。

3.3 通路分析

設定顯著性水平閾值為0.01，得到與PPAR－α顯著性相關的通路有10個，見附表。

附表 與PPAR-α顯著性相關通路列表

如附表所示，與PPAR－α顯著性相關的通路包括最顯著的為脂肪酸代謝通路，顯著性水平為1.85E－17，包含14個差異顯著性基因；其次，依次包含PPAR信號通路、不飽和脂肪酸生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、丙酮酸代謝、視黃醇代謝、脂肪細胞因子信號轉導通路、乙酯代謝、泛酸和輔酶A生物合成以及檸檬烯和蒎烯降解這9個通路。

4 討論

哺乳動物的小腸是消化和吸收飼料以及營養物質的主要場所。小腸上皮組織對這些營養物質分子的吸收主要是通過多個跨膜轉運體來實現，主要包含溶質載體和ATP結合盒這兩個轉運超家族[6－7]。很多研究表明，營養物質影響基因表達作用主要是通過激活或者抑制特定的轉錄因子來實現的[8－9]。其中，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一類重要的受體，其能夠在基因表達水平上調節膳食中脂肪酸及其衍生物代謝作用[10]。同時，PPAR s含三個亞型即α、β和γ，各自具有不同的特點以及生物學功能。PPAR－α已經被證實在小腸中表達量較高[11－12]。然而，目前對于PPAR－α在小腸中調節脂肪代謝的分子遺傳學機制的研究報道較少。

本研究基于表達譜芯片數據分析結果表明，PPAR－α在小鼠小腸組織細胞中調控脂肪代謝過程是通過一系列的相關通路及其關鍵基因起作用的。脂肪細胞分化與糖和脂肪代謝、機體能量平衡、肥胖、Ⅱ型糖尿病、脂肪肝、高血脂及乳腺癌等有著十分密切的關系。在醫學領域，對脂肪細胞分化機制及其調控的研究對于了解、預防和治療這些重大疾病具有重大的理論和現實意義。在動物科學領域，研究動物脂肪細胞分化的調控機理，結合脂肪代謝調控的研究成果，增加脂肪在肌肉內的沉積，減少皮下和內臟的脂肪積累，以實現對動物脂肪沉積的調控，從而改善肉品品質。

目前，PPAR－α作為脂肪代謝過程中重要的轉錄因子已成為研究的熱點[13]。本文通過對在小鼠小腸中與轉錄因子PPAR－α相關芯片的分析，得到了在脂肪酸代謝過程中與PPAR－α相關的靶基因Gyk、Hmgcr等，并獲得了在PPAR－α調控脂肪代謝過程中顯著性參與的一些通路，如PPAR信號通路和脂肪酸代謝通路等。這些都有助于從基因組層面上更好地了解PPAR－α調控小腸脂肪代謝過程作用的機理，從而為實現上述目標提供了重要的分子生物學基礎。

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