褪黑素、谷胱甘肽對豬精液冷凍保存效果的影響

李博玲，馬恒東，王 貞

（四川農業大學動物科技學院，四川 雅安 625014）

本試驗旨在研究褪黑素、谷胱甘肽兩種抗氧化劑對精子冷凍的保護效應。通過對冷凍過程中活性氧（ROS）的檢測以及凍后精子活率、活力、頂體完整性、線粒體活性的檢測，篩選出較佳的抗氧化劑添加搭配組合，為豬凍精技術的發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗對象 健康、性欲旺盛成年杜洛克公豬，2008年10月至2009年4月 ，共采精13次。

1.1.2 試劑及耗材 主要試劑：褪黑素（MLT）、碘化炳碇（PI）、羅丹明 123，均為 Sigma公司產品；谷胱甘肽（GSH）、ROS初級熒光檢測試劑盒購自成都溶海生物技術有限公司；甘油為Amresco公司產品；乳糖購自成都科龍化工試劑廠。

主要耗材：低溫溫度計為北京市宇時技術開發公司生產；倒置熒光顯微鏡為尼康公司生產；電子天平為沈陽龍騰電子有限公司生產；全自動酶標儀為Thermo公司生產；0.5mL冷凍細管為沈陽富士平工業有限公司生產。

1.1.3 冷凍稀釋液和解凍液的配制 見表1。

表1 冷凍稀釋液和解凍液的成分和劑量

1.2 試驗設計 實驗一：在稀釋液中分別單獨添加MLT、GSH，觀察對精液冷凍保存的影響。

實驗二：在稀釋液中聯合添加MLT、GSH，觀察對精液冷凍保存的影響。

實驗三：聯合添加與單獨添加兩種抗氧化劑的比較。

1.3 方法

1.3.1 精液預處理及冷凍 用手握法采集中段精液濃稠部分，并立即用BTS等溫稀釋（1∶1），鏡檢活力在0.7以上的用保溫瓶帶回實驗室。室溫靜置2h，用50mL 離心管分裝、離心（2400×g，3min），去上清后加入乳糖-卵黃稀釋Ⅰ液（1∶1），放入4℃冰箱緩慢降溫、平衡約 2h，再加入乳糖-卵黃稀釋Ⅱ液（1∶1）4℃平衡20min后，裝管，液氮熏蒸（離液氮面 5cm，20min），投入液氮保存。

1.3.2 解凍后精液質量評定

（1）精子活力檢測：精子活力狀態利用BI-靜態分析系統進行觀察、錄像，之后逐一評估。

（2）精子活率和線粒體活性檢測：將解凍的精液用等溫BTS液稀釋，調整精子密度為3×106個/mL。先取等溫的100μL HEPES/BSA緩沖液置于預溫的1.5mL離心管中，然后加入10μL PI貯存液（取0.004g PI溶于2 mL PBS中，0.45 μm濾膜過濾后，-20℃避光貯存）和1μL羅丹明123貯存液（0.004g羅丹明123溶于2mL DMSO中，0.45μm有機相濾膜過濾后，避光保存），避光孵育10min，最后加入50μL精液，在37℃、黑暗潮濕環境下孵育30min。取10μL精子懸液于載玻片上，加蓋玻片，熒光顯微鏡（200×）下觀察。死精子在波長540～580nm紫外光激發下頭部核區發出紅色熒光，活精子和有活性線粒體的精子在波長511～534nm紫外光激發下頭部不發光，而尾巴線粒體部分（中段）有亮綠色熒光。計算精子活率（活精子百分率）和有線粒體活性的精子百分率。

（3）頂體完整性檢查：進行姬姆薩染色制片鏡檢。①制片：取10μL精液于載玻片一頭，用一邊緣整齊的玻片呈35°角將精液樣品均勻拖布于載玻片上，自然風干，制成精液涂片。②固定：立即吸取10%福爾馬林固定液1～2mL滴于自然風干的涂片上，固定15min，用水輕輕沖洗，洗去固定液，再自然風干。③染色：將姬姆薩染液滴于涂片上，染色1.5h，然后用水輕輕沖洗，晾干備檢。

判定：頂體完整的精子頭部外形正常，細胞膜和頂體完整著色均勻，頂脊、赤道段清晰。鏡檢計數200個精子，計算頂體完整精子的百分率。頂體完整率=頂體完整精子數/總精子數×100%

（4）ROS測定：利用ROS初級熒光測定試劑盒進行檢測，按說明進行。結果判定：熒光單位（RFU）值越高，ROS含量越高。

1.4 數據處理 應用SPSS13.0 One-Way ANOVA軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單獨添加MLT、GSH對精液冷凍保存的影響

2.1.1 MLT對解凍后精液質量的影響 由表2可以看出，添加0.125mg/mL、0.25mg/mL的褪黑素均能顯著提高精子活率（P＜0.05），但兩種濃度之間差異不顯著。當加入0.25mg/mL褪黑素時，能顯著提高精子活力（P＜0.05）；添加 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL褪黑素均能顯著提高凍后精子的頂體完整性（P＜0.05），其中以 0.25 mg/mL 的效果最佳（P＜0.05）；加入0.25 mg/mL褪黑素能顯著提高凍后線粒體活性（P＜0.05）。說明褪黑素對頂體的保護作用較好，同時也能改善活率、活力以及線粒體活性。添加0.125mg/mL、0.25mg/mL的褪黑素，解凍后精子中的ROS含量下降，較對照組差異顯著（P＜0.05），且添加0.25mg/mL的效果最佳（P＜0.05）。

表2 添加不同濃度的MLT對解凍后精子質量的影響

2.1.2 GSH對解凍后精液質量的影響 由表3可以看出，添加5mmol/L的GSH能極顯著提高精子凍后活率、活力、線粒體活性（P＜0.01）；添加 1mmol/L、5mmol/L的GSH均能顯著提高凍后精子的頂體完整性（P＜0.05），但兩濃度之間差異不顯著；添加GSH能顯著降低凍后精子內ROS的含量。當加入10mmol/L GSH時，精子質量指標有所下降，說明GSH添加不能過量。

表3 添加不同濃度的GSH對解凍后精子質量的影響

2.2 MLT與GSH聯合添加對解凍后精液質量的影響 多重比較結果表明，對于活率，M1G1、M1G2顯著優于 M2G1，M2G2顯著優于 M2G1（P＜0.05），M1G1、M1G2顯著優于M2G2（P＜0.05）；對于活力，M1G1顯著優于M2G1和M2G2，M1G2顯著優于M2G1（P＜0.05）；對于頂體完整率和線粒體活性，各組之間差異顯著，M1G1顯著優于其他各組（P＜0.05）。總的來說，M1G1為聯合添加最佳組合。

表4 MLT與GSH交互作用的組內比較

2.3 單獨添加與聯合添加抗氧化劑的比較 由表5可以看出，聯合添加MLT與GSH較單獨添加，其精子活率、活力、頂體完整性有顯著提高（P＜0.05）；線粒體活性無顯著差異；單獨添加與聯合添加MLT、GSH均能顯著降低ROS含量（P＜0.05）。聯合添加與單獨添加的效果差異顯著（P＜0.05），說明MLT與GSH之間存在顯著的交互效應。

表5 單獨添加與聯合添加的比較

3 分析

MLT在本次試驗中是第一次用于豬精液的冷凍保存。商學軍等（2004）曾在精子模型中加入MLT共同孵育，觀察其對線粒體功能的保護作用，結果顯示MLT通過清除ROS，對精子線粒體具有重要的保護作用。本試驗在冷凍稀釋液中加入MLT，結果發現加入0.25mg/mL時，精子活率、活力、線粒體活性、頂體完整性都有顯著提高（P＜0.05），且解凍后精子ROS含量顯著下降（P＜0.05）。GSH是一種重要的抗氧化劑，其本身易受某些物質氧化，所以它在體內能夠保護許多蛋白質和酶等分子中的巰基不被自由基等有害物質氧化。GSH能直接與過氧化氫等氧化劑結合，生成水和氧化型谷胱甘肽。本試驗在冷凍稀釋液中加入5mmol/L的GSH，結果顯著提高了凍后精子的活率、活力及線粒體活性（P＜0.05）。

4 結論

褪黑素與谷胱甘肽具有顯著的交互效應，褪黑素的存在提高了谷胱甘肽的抗氧化效率，因此，只有將兩種抗氧化劑同時用于豬精液冷凍保存，才能更好地保護豬精子免受抗氧化損傷，達到提高解凍后精子質量的目的。

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