不同采收期山茱萸總有機酸的含量變化規律研究

陳磊磊 陳隨清 王 靜

(河南中醫學院藥學院辦公室，河南省鄭州市金水區金水路1號，450008)

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)除去果核的干燥成熟果肉［1］，主產于我國的河南、浙江、陜西等省，具有補益肝腎、澀精固脫的功效，為常用中藥材。現代研究證明:山茱萸中含有多種成分，如環烯醚萜苷類、有機酸類、鞣質類、多糖、氨基酸、維生素及礦質元素等。其中有機酸種類多、含量豐富，如熊果酸、齊墩果酸等［2］。目前發現多種有機酸均有生理活性，如齊墩果酸具有清熱、保肝、消炎、抑菌、強心、利尿等作用［3］。研究不同采收期山茱萸總有機酸含量變化，可以為山茱萸最佳采收期提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料及試劑 山茱萸藥材分別采自河南西峽、浙江臨安、陜西佛坪，經鑒定為山茱萸科植物山茱萸果實(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.);酒石酸(天津石英鐘廠霸州市化工分廠，純度99.5%);氫氧化鈉，鄰苯二甲酸氫鉀，酚酞，乙醇均為分析純;雙蒸水(自制)。

1.2 儀器 數控超聲波清洗器(KQ-500DV，昆明市超聲儀器有限公司);pH計(PHS-2C，上海大譜儀器有限公司);磁力攪拌器(78-HW，金壇市文華科教實驗儀器廠);恒溫水浴鍋(HH-S，鞏義市英峪予華儀器廠);電子天平(BS224S，北京賽多利斯儀器系統有限公司);熱風循環烘箱(CT-C，常州市干燥設備廠有限公司)。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的酒石酸1.5g，置100mL容量瓶中，加80%乙醇溶解并定容至刻度，配制成15.005mg/mL的酒石酸溶液，備用。

2.2 NaOH溶液的配制 取氫氧化鈉飽和溶液上清液5.6mL，加新沸過的冷水定容至1000mL，密封保存，標定后使用。

2.3 樣品溶液的制備 精密稱取山茱萸粉末5.0g，置于具塞錐形瓶中，加入10倍量80%乙醇溶液，稱重，超聲30min，補齊重量，過濾。濾渣重復提取1次，合并濾液，備用。

2.4 樣品溶液提取方法學考察 為系統考察各種因素對提取結果的影響，采用正交實驗，考察提取方法、乙醇濃度、提取時間、提取次數4個因素，測定總有機酸含量，選用L9(34)正交表設計，因素、水平見下表1，實驗結果和方差見表2、表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗設計及結果

表3 提取方法考察 方差分析表

由表2可以看出影響山茱萸總有機酸提取的主次因素為:B＞D＞C＞A，從均值可看出最佳提取方案為:A2B2C2D3。從表3可看出P＞0.05，各因素對提取結果影響無顯著性差異。最終選擇超聲提取，80%乙醇，提取時間1h，提取2次作為最佳提取條件，采用此方法對山茱萸樣品總有機酸進行3次提取試驗，提取的總有機酸含量平均為10.51%。

2.5 測定方法 參照《中國藥典》2010年版附錄ⅧA電位滴定法與永停滴定法［4］，精密移取20mL待測溶液置于250mL錐形瓶中，置電磁攪拌器上，將連接有pH計的pH復合電極插入液面下，放入攪拌子，開啟攪拌，記錄電位值，用0.1mol/L NaOH滴定液滴定，開始時可每次加入較多的量，攪拌，記錄電位;至將近終點前，則應每次加入少量，攪拌，記錄電位;至突躍點已過，仍應繼續滴加幾次滴定液，并記錄電位。照電位滴定法確定滴定終點的方法計算滴定終點。

2.6 酒石酸對照品突躍范圍模擬試驗 準確吸取酒石酸對照品溶液 20mL，按 2.4項測定方法，用0.1178mol/L NaOH滴定液測定。酒石酸對照品一階導數滴定曲線和二階導數滴定曲線分別為圖1-A，圖1-B。由圖1-A可見曲線對應的最大值為44.95mL，圖 1-B可計算出曲線過原點的值為44.91mL，曲線顯示滴定終點明顯。二階導數計算過程能減少滴定誤差造成的影響，使結果更準確，因此本實驗結果采用二階導數進行計算。

2.7 電位滴定方法學考察

2.7.1 標準曲線的建立 從酒石酸對照品溶液中分別吸取 5mL、8mL、20mL、40mL，用 80% 乙醇稀釋至50mL，以上5個濃度分別用2.4項下電位滴定法測定，以消耗的NaOH的量為縱坐標，以所含酒石酸的量為橫坐標，建立標準曲線，得回歸方程Y=17.584x-0.1176，R2=0.9999，表明酒石酸在 0.0300mg ～0.3001mg線性關系良好。

2.7.2 穩定性考察 稱取樣品粉末10.0020g，按2.3項方法提取得樣品液，分別在 0、2、4、8、12、20h，按 2.4項進行測定，計算RSD值為0.39%，表明樣品液在20h內穩定。

2.7.3 精密度考察 稱取樣品粉末10.0014g，按2.3項方法提取得樣品液，按2.4項下測定6次，計算RSD值為0.48%，表明本法精密度良好。

2.7.4 重現性考察 取同一山茱萸樣品粉末6份，按2.3項方法提取得樣品液，按照2.4項下進行測定，計算RSD值為1.55%，表明本法重現性良好。

2.7.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的樣品粉末5份，加入與樣品含量相近的酒石酸標準品，按2.3項方法制備樣品溶液，按照2.4項下進行測定，計算加樣回收率平均值為101.44%，RSD值為1.56%。

3 實驗結果

按2.3項方法制備樣品溶液，按照2.4項下進行測定，計算樣品中酒石酸的含量。3個地方不同采收期山茱萸藥材的樣品總有機酸含量測定結果。見表4。

表4 3個地方山茱萸樣品總有機酸含量(%)

4 討論

4.1 對測定結果分析，3個產地的樣品總有機酸含量隨果實的逐漸成熟呈增長趨勢，說明總有機酸有一個逐漸積累的過程。同一時期3個產地樣品的總有機酸含量差異較大，但對總有機酸達到相近含量的時間進行比較，顯示陜西比河南、浙江提前20天左右，這與3個地區山茱萸成熟期和傳統采收期的差異一致。通過本實驗可看出山茱萸總有機酸含量與山茱萸果實成熟期有相關性，山茱萸總有機酸含量動態變化規律可以為確定最佳采收期提供依據。

4.2 總有機酸測定多采用酸堿滴定法，由于中藥材提取液顏色較深，使指示劑的選擇受到限制，同時滴定終點不明顯，用活性炭脫色會對有機酸有一定吸附，影響測定結果。我們采用直接電位滴定法，避免酸堿滴定法中有機酸提取液顏色對滴定終點的干擾，結果表明電位滴定法測定山茱萸總有機酸，方法的重現性、精密度、穩定性都比較好，可操作性強。

4.3 在提取過程中，比較了水、丙酮和50%乙醇3種不同溶媒的提取效率，結果水和50%乙醇對總有機酸提取率較高，50%乙醇提取液在滴定中突躍明顯，所以在提取方法考察中選取不同濃度的乙醇進行考察。

［1］中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部)［S］.北京:化學工業出版社，2010:26.

［2］李平，余象煜.山茱萸果實的化學成分.中國野生植物資源，1990，(3):13.

［3］楊劍芳，路福平，高文遠，等.山茱萸的化學、藥理及開發應用研究進展.現代生物醫學進展，2006(12):127-131.

［4］中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部附錄)［S］.北京:化學工業出版社，2010:46.