藤茶對非酒精性脂肪性肝病的治療作用研究

王俊杰，舒 洋，曹 欣，蔣顯勇，吳海燕，陳福春，方會龍，陳東林

藤茶 (ampelopsis grossedentata)是葡萄科植物蛇葡萄屬中的一種野生藤本植物的嫩莖葉，多生長在海拔200～800 m高的山地上，主要分布于廣西、廣東、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等地。長久以來，我國壯族和瑤族人將其嫩莖葉制成保健茶，用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、瘡癤等癥。其化學成分主要為黃酮類、低聚芪類、酚類［1］，其中黃酮類中的二氫楊梅素含量豐富，在幼葉莖中含量占干重的20%以上，在幼葉中可達40%［2］。我們報道了藤茶及其主要成分二氫楊梅素具有護肝和抗肝纖維化的作用［3－7］，本研究在此基礎上進一步研究藤茶提取物對小鼠非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的保護作用，為其保健功效的評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠48只〔合格證號:Scxk(湘)2009－0012〕，雄性，體質量18～22 g，購自長沙市開福區東創實驗動物科技服務部。實驗前適應環境3 d，自由飲水。

1.2 儀器和試劑 儀器:Au640型全自動生化分析儀 (日本Olympous公司)，TSJ－O脫水機 (常州市中威電子儀器廠)，BMJ－Ⅲ型包埋機 (常州市中威電子儀器廠)，Olympus顯微鏡 (日本Olympous公司)。試劑:膽固醇、丙硫氧嘧啶、膽酸鈉，均購于上海藍季生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藤茶提取物的制備 采摘郴州王仙嶺后山藤茶，晾干，粉碎，95℃熱水提取10 min(料液比1∶20)，過濾。濾渣微波加熱3 min后合并濾液，加熱提取，過濾，濾液室溫下冷卻，析出晶體，干燥得藤茶提取物。吸光度法測定純度:標準品計算藥物濃度與吸光度的標準曲線。待測藥品溶液加入5%AlCl3溶液3 ml，用95%乙醇定容至10 ml，搖勻后室溫靜置40 min，在404 nm波長下測定吸光度值，標準曲線計算藥物濃度。

1.3.2 造模方法 小鼠高脂飼料喂養，自由飲水。高脂飼料配方:添加2%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉到基礎飼料中，混合均勻，壓制成條。

1.3.3 分組 48只小鼠隨機分為4組，每組12只，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組及藤茶治療組。正常對照組:正常方法飼養60 d，普通條形飼料喂養;模型組:高脂飲食60 d制備NAFLD模型;陽性對照組:在模型組高脂飲食的基礎上灌胃易善復 (多烯磷脂酰膽堿膠囊)150 mg/kg，從實驗第14天開始，1次/d，共治療42 d;藤茶治療組:在模型組高脂飲食基礎上灌胃藤茶提取物300 mg/kg，從實驗第14天開始，1次/d，共治療42 d。

1.3.4 實驗方法 (1)實驗第60天處死4組小鼠。動物處死前禁食12 h，稱體質量，眼眶內眥取血后分離血清，用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶 (AST)、總膽固醇 (TC)、三酰甘油 (TG)。(2)迅速剪開腹腔，觀察肝臟形態。取出完整肝臟，濾紙吸干表面水分后稱重，計算肝指數，肝指數=肝臟質量 (mg)/體質量(g)×100%。(3)完整分離肝臟左葉，用4%多聚甲醛固定，脫水，包埋，切片，HE染色，封固，光鏡下觀察肝組織病理變化并進行分級和評分，方法為:在顯微鏡下肝細胞內含脂滴細胞數/總細胞數比值為0、＜1/3、1/3～2/3、＞2/3～1，分別判定為 － (0分)、+(1分)、++(2分)、+++(3分)、++++(4分)［8］。(4)完整分離肝臟中葉，剪取100 mg，測定肝臟TC、TG。肝臟TC、TG測定方法為:取肝組織加9倍體積的異丙醇，在冰水中制成10%的勻漿，4℃提取24 h，3 000 r/min離心10 min，提取上清液，用全自動生化分析儀測定TG、TC含量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計檢驗。計量資料以表示，多組間均數的比較采用方差分析;等級資料的比較采用秩和檢驗。p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藤茶提取物測定 吸光度法測定純度標準曲線的回歸方程為:A=6.21x+0.0105(A為吸光度，x為藥物濃度)，R=0.997639。實驗用藤茶提取物二氫楊梅素含量為45.01%。

2.2 肝臟形態學觀察及肝指數變化 正常對照組小鼠肝臟顏色紅潤，表面光滑，邊緣銳利，包膜完整，質地柔軟。模型組小鼠肝臟顏色呈暗褐色，肝臟腫大，質脆，包膜緊張，散在分布白色脂滴，表面均勻分布顆粒狀突起。經易善復或藤茶治療后，小鼠肝臟為褐色，肝臟大小及質地較模型組明顯改善，散在少量分布白色脂滴，表面均勻分布顆粒狀突起。

正常對照組、模型組、陽性對照組、藤茶治療組小鼠肝指數分別為 (41.3±4.1)mg/g、(53.5±3.4)mg/g、(48.5±3.6)mg/g和 (48.7±3.1)mg/g，4組間比較差異有統計學意義 (F=21.36，p＜0.05)。模型組與正常對照組比較，陽性對照組與模型組比較，藤茶治療組與模型組比較，差異均有統計學意義 (p＜0.01);但陽性對照組與藤茶治療組比較，差異無統計學意義 (P＞0.05)，這兩組與正常對照組比較，差異仍有統計學意義 (p＜0.01)。

2.3 肝組織病理變化 光鏡下，正常對照組小鼠肝組織結構正常，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，肝細胞無脂肪變性，細胞結構清晰，細胞質豐富，細胞核位于細胞中央。模型組小鼠肝臟呈中或重度脂肪變性，以中央靜脈周圍明顯，肝細胞腫脹呈圓形，細胞核被擠向一邊，胞質內充滿大量脂肪空泡，脂滴大小不等，甚至融合成大脂滴，界限不清楚。陽性對照組及藤茶治療組小鼠較模型組脂肪變性細胞明顯減少，脂滴減少或消失，肝細胞結構基本恢復正常 (見圖1)。

圖1 小鼠肝組織切片的形態改變 (HE染色，×100)Figure 1 Histopa－thological changes of mice liver

根據肝脂肪變性程度級別標準，計算肝脂肪變性評分，4組小鼠肝脂肪變性評分比較，差異有統計學意義 (F=16.40，P=0.00);模型組小鼠肝脂肪變性評分顯著高于正常對照組，陽性對照組和藤茶治療組又顯著低于模型組，差異均有統計學意義 (p＜0.05)，但陽性對照組與藤茶治療組比較差異無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

2.4 肝功能及血脂變化 模型組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平較正常對照組顯著升高 (p＜0.01)，陽性對照組和藤茶治療組小鼠血清中ALT、AST、TC、TG水平較模型組顯著降低，差異有統計學意義 (p＜0.05);但陽性對照組與藤茶治療組小鼠的上述指標比較差異無統計學意義 (P＞0.05，見表2)。

2.5 肝臟TC、TG變化 4組小鼠肝臟組織中TC、TG含量比較，差異有統計學意義 (p＜0.05);模型組小鼠肝臟組織中TC、TG含量較正常對照組顯著升高 (p＜0.01);陽性對照組和藤茶治療組小鼠肝臟組織中TC含量均較模型組顯著降低(p＜0.05)，與正常對照組比較差異無統計學意義 (P＞0.05);藤茶治療組肝臟TG含量較模型組顯著降低，差異有統計學意義 (p＜0.05);陽性對照組和藤茶治療組TG含量與正常對照組比較，差異有統計學意義 (p＜0.01，見表3)。

表1 4組小鼠肝臟脂肪變性情況比較Table 1 Comparison of degrees of hepatic fatty degeneration among the four groups

表2 4組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較Table 2 Comparison of serum ALT，AST，TC，and TG levels among the four groups

表2 4組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較Table 2 Comparison of serum ALT，AST，TC，and TG levels among the four groups

注:與正常對照組比較，*p＜0.01;與模型組比較，△p＜0.05，★p＜0.01

組別 只數 ALT(U/L)AST(U/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常對照組 11 48± 7 76±14 2.14±0.25 1.06±0.14模型組 11 162±33* 182±25* 4.12±0.33* 1.32±0.15*陽性對照組 9 110±22＊★ 134±21＊★ 3.82±0.22＊△ 1.11±0.11△藤茶治療組 10 120±14＊★ 138±17＊★ 3.75±0.20＊△ 1.08±0.14△F 值0.00 0.00 0.00 0.0003 51.09 52.84 126.03 8.20 P值

表3 4組小鼠肝組織TC、TG含量比較Table 3 Comparison of hepatic levels of TC and TG among the four groups

表3 4組小鼠肝組織TC、TG含量比較Table 3 Comparison of hepatic levels of TC and TG among the four groups

注:與正常對照組比較，*p＜0.01;與模型組比較，△p＜0.05

組別 只數 TC(mmol/L) TG(mmol/L)正常對照組 11 0.38±0.08 0.16±0.04模型組 11 0.52±0.03* 0.28±0.05*陽性對照組 9 0.45±0.04△ 0.25±0.01*藤茶治療組 10 0.40±0.11△ 0.21±0.03＊△F 值＜0.01 ＜0.01 8.46 21.14 P值

3 討論

NAFLD是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝以及由其演變的非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化。隨著人們生活水平的提高及生活方式和飲食結構的改變，NAFLD在我國的發病率越來越高，發病年齡趨向低齡化，已成為一種嚴重威脅人類健康的疾病。

Day和James提出以氧應激/脂質過氧化為核心的“二次打擊”學說［9］，認為:各種狀態所致的脂肪沉積與胰島素抵抗是脂肪性肝炎的第一次打擊;而氧化應激/脂質過氧化是脂肪肝病程進展中的第二次打擊，二次打擊是脂肪變性發展為脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化的轉折點。及時去除病因及誘因、減輕肝臟脂肪沉積，抑制氧化應激可能是防治脂肪性肝炎的有效措施。

我國藤茶資源豐富，來源廣泛，其有效成分二氫楊梅素含量豐富，實驗采用的藤茶提取物二氫楊梅素的含量為45.01%。本研究發現，藤茶可以明顯改善NAFLD小鼠肝臟脂肪變性，具有潛在的治療NAFLD的作用;還可以降低肝臟TC、TG含量及血清TC、TG、ALT、AST水平，表現出一定的降脂和肝保護作用。此外，有文獻報道，藤茶還具有調節免疫、抗炎、抗氧化等作用［10］。因此，長期飲用藤茶具有治療NAFLD的功效，其機制與藤茶抗炎抗氧化、保護肝臟、減輕肝臟脂質沉積有關。

1 Lu A，Tang Y，Ran R，et al.Brain genomics of intracerebral hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26(2):230－252.

2 李翠蘋，曹樹穩，余燕影.二氫楊梅素研究進展［J］.化學試劑，2010，32(7):608－612.

3 方會龍，王俊杰，陳美姿，等.藤茶提取物對血吸蟲病肝纖維化的影響［J］.中國全科醫學，2010，13(6):2004－2006.

4 鄺滿元，劉映霞，李映菊，等.藤茶總黃酮抗大鼠肝纖維化的作用 ［J］.南華大學學報醫學版，2008，36(6):745－747.

5 方會龍，王俊杰，陳美姿，等.二氫楊梅素治療血吸蟲病肝纖維化的實驗研究［J］.中國臨床藥理學與治療學，2010，15(4):381－384.

6 鄺滿元，賈蕾，羅明英.二氫楊梅素對肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標的影響［J］.中國民族民間醫藥，2009，8(2):46－47.

7 鄺滿元，賈蕾，羅明英.二氫楊梅素對肝纖維化大鼠脂質過氧化損傷的保護作用［J］.中國醫藥導報，2009，6(18):26－28.

8 葛麟，譚正懷，唐大軒，等.輕肝顆粒對小鼠非酒精性脂肪肝的作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2009，25(2):94－97.

9 Day CP.Steatohepatitis:a tale of two"hits" ［J］.Gastroenterology，1998，114:842－845.

10 魏來，趙春景.番茄紅素對非酒精性脂肪肝模型大鼠肝細胞色素P_ (450)2E1及腫瘤壞死因子－α表達的影響 ［J］.中國藥房，2010，33(5):3100－3102.