甘露聚糖酶與番茄果實硬度的關系

張丙秀 李景富 王傲雪 許向陽

（東北農業大學園藝學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

細胞壁成分的解離是果實軟化的直接原因（Fischer & Bennett，1991），番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）果實細胞壁主要由半纖維素、纖維素、果膠和蛋白組成，占干物質質量的90 %（Redgwell & Fischer，2002），番茄果實半纖維素中的甘露糖多以甘露聚糖的形態存在（Seymour et al.，1990），甘露聚糖酶（Endo-β-1, 4-mannanas）的功能就是水解甘露聚糖之間的β-1, 4共價鍵（Bewley，1997）。番茄不成熟突變體及一些能正常成熟品種果實中甘露聚糖酶活性很低或沒有活性，這些品種果實的軟化程度較慢（Bewley et al.，2000；Banik et al，2001），所以該酶可能與果實的軟化相關，但還不明確該酶在果實軟化中是否起到重要作用。目前，番茄果實中的甘露聚糖酶基因已經被克隆出來，被命名為LeMan4基因（Carrington et al.，2002）。反義 RNA技術是研究基因功能的一種有效途徑（宋艷茹和馬慶虎，1995），該技術在油菜（Knutzon et al.，1992）、蘋果（Dandekar et al.，2004）、西洋梨（Gao et al.，2007）等作物上得到了成功的應用。在蔬菜學領域，研究較深入的就是耐貯運番茄的培育，Hamilton等（1990）將ACC氧化酶的反義RNA導入番茄植株，使成熟果實的乙烯產生受到97 %的抑制，轉基因番茄在室溫下的貯存時間明顯比對照長。反義RNA技術在保鮮貯存方面研究的誘人前景，已成為選育耐貯藏果樹新品種有效的途徑之一（Petri & Burgos，2005）。鑒于此，本試驗構建了LeMan4基因反義表達載體并將其導入番茄基因組，以期獲得LeMan4基因表達的缺陷型植株，探討LeMan4基因在番茄果實軟化中的作用，并為選育耐貯番茄新品種提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

植物材料：番茄品種Micro-Tom，由東北農業大學番茄課題組提供。

菌株及載體：大腸桿菌DH5α、農桿菌EH105及載體pBI121，由東北農業大學番茄課題組提供。

試劑：LA Taq DNA聚合酶、DL 2000marker、各種限制性內切酶（SmaⅠ、SacⅠ及HindⅢ）、RT-PCR試劑盒購于 TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自上海華舜公司；pGEM-Teasy Vector，T4DNA連接酶為Promaga公司的產品；MS Salts為Sigma公司產品；Trizol及引物購于上海生工生物工程技術服務有限公司；Southern 雜交采用羅氏的地高辛試劑盒；其他試劑均為國產的分析純。

1.2 方法

1.2.1 果實硬度的測定 按照不同成熟度分為4個時期采果實測定：G，綠熟期（果實亮白，或轉色面積不超過10 %）；T，轉色期（果實表面10 %～60 %轉為淡黃或紅色）；OR，橙紅期（果實表面60 %以上轉為全黃或紅色）；R，紅熟期（果實著色為全黃或全紅）。

每個處理5個果實，采用手持式果實硬度計（FHM5），沿番茄果實赤道線中部（即果實最大橫徑處）對著心室腔隨機取3點測試硬度，取平均值。

1.2.2 番茄果皮總RNA提取及LeMan4 cDNA的克隆 番茄果皮總RNA提取依照Trizol試劑的說明書進行。

根據Genebank登陸的LeMan4 cDNA序列設計引物，兩條引物的5' 端插入限制性內切酶位點，并在酶切位點之外再加上了兩個保護堿基，在上游引物的5' 端加上AACA框和起始密碼子。上游引物（P1）：5' TCCCCCGGGAACAATG CTATGATAGCTTAGAGAGCC，下游引物（P2）：5' CGAGCTC CTAATGAATAACTCAATCATCTTAATTTTTG。

以番茄果皮總RNA為模板，P1、P2為PCR 引物進行RT-PCR。cDNA第一鏈的合成反應條件為30 ℃ 5min，42 ℃ 3 h，95 ℃ 5min滅活逆轉錄酶；PCR反應條件：94 ℃變性5min，94 ℃變性30 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環，最后72 ℃保溫10min。獲得的PCR產物純化后克隆到pGEM-Teasy上，轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和質粒酶切初步鑒定后測序，獲得克隆載體。

1.2.3 LeMan4反義基因植物表達載體的構建 用 SmaⅠ和 SacⅠ將克隆載體上的目的基因切下，插入載體pBI121的相應克隆位點，構建植物表達載體（圖1）。采用菌落PCR法和限制性內切酶酶切法進行鑒定。

1.2.4 反義LeMan4的轉化及檢測分析 采用凍融法將表達載體導入根癌農桿菌 EHA105（王關林和方宏筠，2002）。葉盤法轉化番茄（McCormick et al.，1986）。將番茄種子用70 %乙醇浸泡30 s后，用10 %次氯酸鈉消毒15min，接種于無菌苗培養基（MS+蔗糖15g·L-1+瓊脂 7 g·L-1），置于（26±2）℃、16h光照培養，待子葉展開時，在無菌條件下切下子葉放在培養基（MS+NAA 1mg·L-1+BAP 1mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 8g·L-1）中預培養1d。挑取pBI121-RLeMan4單菌落，接種于5mL含卡那霉素50mg·L-1的YEP液體培養基中，28 ℃、200 r·min-1振蕩過夜培養，菌液長至OD600=0.4～0.6時，按1∶10的比例稀釋菌液，再進行二次活化，OD600=0.5～0.6時，4 ℃、2000 r·min-1離心 10min，收集細菌細胞，用 2 % MS液體培養基懸浮沉淀至OD600=0.5左右，以該菌液對外植體進行侵染。將預培養后的外植體放入農桿菌菌液中侵染 20min，其間輕輕搖動幾次，放入共培養基（MS+NAA 1mg·L-1+BAP 1mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8g·L-1）中48h后，轉移至芽誘導培養基〔MS+頭孢噻肟鈉500mg·L-1+卡那霉素50mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 7 g·L-1+ZT 2mg·L-1（14d后 ZT 1mg·L-1）〕，每隔 14d繼代1次，以未侵染的子葉為對照，形成芽的外植體切成小塊轉移到芽伸長培養基（MS+ZT 1mg·L-1+GA 1mg·L-1+蔗糖 15g·L-1+瓊脂7 g·L-1+頭孢噻肟鈉500mg·L-1+卡那霉素40mg·L-1），每隔10d繼代1次，當芽長至2～4cm時切離外植體，轉至生根培養基（MS+IBA 1mg·L-1+蔗糖15g·L-1+瓊脂8g·L-1+頭孢噻肟鈉500mg·L-1+卡那霉素40mg·L-1）。植株長到5cm可馴化移栽到土中。

再生番茄植株的基因組 DNA采用 CTAB法提取。根據 NptⅡ序列設計引物：上游引物為5' ACTGGGCACAACAGACAA 3'，下游引物為5' CCGTAAAGCACGAGGAA 3'，以再生番茄基因組DNA為模板，進行抗性植株的PCR檢測，PCR擴增條件：94 ℃預變性5min，94 ℃變性1min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1min，35個循環，循環結束后72 ℃ 10min，4 ℃ 30min，終止反應。取PCR陽性植株基因組DNA 5～10μg，經Hind Ⅲ單酶切，以標記的NptⅡ探針進行Southern 雜交檢測。

圖1 反義表達載體pBI121-RLeMan4

2 結果與分析

2.1 LeMan4 cDNA的克隆、反義LeMan4植物表達載體的構建及農桿菌的轉化

提取番茄果皮 RNA并進行逆轉錄，以逆轉錄產物為模板，P1和 P2為引物，55 ℃進行PCR擴增，瓊脂糖電泳分析表明PCR 產物的長度在1200 bp左右，如圖2。PCR 產物回收后與載體T-easy vector連接，酶切鑒定后（圖3），交由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果在Genebank上經Blast 比對與番茄果實LeMan4 cDNA序列同源性達100 %，將此克隆命名為 T-LeMan4。分別用限制性內切酶 SacⅠ和 SmaⅠ雙酶切 pBI121質粒及T-LeMan4質粒。回收pBI121酶切產物的較大片斷及T-LeMan4的小片斷，二者4 ℃過夜連接。取連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，然后涂布在含有卡那霉素（50mg·L-1）的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜后選取菌落用于PCR檢測，檢測為陽性的菌落的質粒用SacⅠ和SmaⅠ進行雙酶切鑒定，如圖4。pBI121切下大小為1800 bp左右的GUS片斷，質粒切下的片斷大小為 1200 bp，證明 LeMan4反義基因已連接到 pBI121上。采用凍融法將重組質粒pBI121-RLeMan4轉化制備好的農桿菌EHA105的感受態細胞，經含Km（50mg·L-1）+Rif（50mg·L-1）的YEB 平板篩選，挑取轉化菌落，堿裂解法小量提取質粒后，進行限制性內切酶酶切鑒定，如圖5。結果證明pBI121-RLeMan4已成功轉化農桿菌菌株EHA105。

圖2 RT-PCR產物電泳結果分析

圖3 SacⅠ/SmaⅠ雙酶切T-LeMan4

圖4 pBI121-RLeMan4雙酶切檢測

圖5 pBI121-RLeMan4轉化農桿菌雙酶切檢測

2.2 番茄的遺傳轉化

無菌條件下切下無菌苗子葉放于預培養基中培養1d后進行侵染。共培養48h后轉移至芽誘導培養基培養，14d后對照變白最后死亡，形成芽的外植體切成小塊轉移到芽伸長培養基，每隔10d繼代1次，當芽長至2～4cm時切離外植體，轉至生根培養基。植株長到5cm馴化移栽到土中。植株長至10cm定植到溫室。番茄品種Micro-Tom的遺傳轉化過程見圖6，最終得到反義RNA抗性植株20株。

2.3 轉基因植株的分子生物學

2.3.1 轉基因植株的PCR檢測 提取的抗性苗葉片總DNA經0.8 %瓊脂糖檢測表明質量較好，可以用于PCR擴增。根據NptⅡ序列引物，以質粒為陽性對照，非轉基因植株為陰性對照，對獲得的再生植株進行PCR檢測，擴增片斷長度為667 bp。擴增結果如圖7。20株抗性植株中有13株表現為陽性。

2.3.2 轉基因植株的Southern Blot檢測 以質粒pBI121-RLeMan4為模板，利用NptⅡ基因片段設計的引物進行PCR擴增，然后回收PCR產物制備探針。提取 PCR檢測為陽性植株的總DNA，經HindⅢ酶切，以標記的NptⅡ探針進行Southern雜交。由圖8可見，在雜交后的膜上出現了雜交帶，而陰性對照（非轉基因植株）無雜交帶。由此推斷，NptⅡ基因片段已經整合到番茄的基因組中。最終，得到陽性的轉基因植株11株。

圖6 番茄葉片再生及抗性植株篩選

圖7 pBI121-RLeMan4轉化植株的PCR檢測

圖8 pBI121-RLeMan4轉化番茄的Southern檢測

2.4 轉基因植株的甘露聚糖酶活性及硬度檢測

轉基因植株溫室定植后，成活7株。從圖9可以看出，在綠熟期和轉色期，甘露聚糖酶的活性被完全抑制，橙紅期后，各轉基因果實又檢測到甘露聚糖酶活性，但都在非轉基因植株的12.2 %以下。在轉色期和橙紅期，果實硬度比對照高出較多，品系R7在橙紅期比對照高出18.2%。紅熟期后各轉基因植株果實與對照硬度的差距減小。這可能是番茄果實內源甘露聚糖酶基因在橙紅期后轉錄增強的結果。

圖9 轉基因植株果實甘露聚糖酶活性的變化

圖10 轉基因植株果實硬度的變化

3 結論與討論

本試驗從Micro-Tom果實得到甘露聚糖酶基因，并構建出反義RNA表達載體pBI121-R LeMan4。采用農桿菌介導法轉化番茄，獲得PCR陽性植株13株，Southren雜交陽性植株11株，為研究該基因在番茄果實成熟軟化中的作用提供了試材。各轉基因植株果實的甘露聚糖酶活性被抑制在12.2 %以下，但都能夠成熟和軟化，只是果實硬度比對照高，這說明甘露聚糖酶活性與果實軟化有關，但卻不是番茄果實成熟軟化的必要因子。

利用反義 RNA技術對基因的表達進行抑制可以產生突變體，從而研究特定基因對細胞發育、分化及功能的影響，該技術在一些作物上得到了成功的應用。本試驗通過反義 RNA 技術獲得了LeMan4表達缺陷植株，但沒有對轉基因植株果實的LeMan4的基因表達量進行檢測，但其抑制效果已經在生理水平上進行驗證。

本試驗結果證明甘露聚糖酶活性與果實軟化有關，但甘露聚糖只占細胞壁成分的一小部分（Huysamer et al.，1997）。所以，甘露聚糖的降解可能通過間接途徑影響了果實軟化。例如，甘露聚糖降解所產生的甘露糖或甘露聚糖的寡糖可能用于半纖維素的重新合成（Bewley et al.，2000），這就有可能改變細胞壁中半纖維素、纖維素及果膠的連接方式，影響細胞壁結構的穩定性，使細胞壁更容易被其他水解酶降解。另外，本試驗中甘露聚糖酶的活性雖然被抑制在較低水平，但轉基因果實仍能成熟，只是硬度的變化受到影響，這說明甘露聚糖酶活性不是番茄果實成熟軟化的必要因子，甘露聚糖酶很可能與其他細胞壁降解酶或修飾酶等協同作用，共同參與果實發育（王傲雪 等，2006）。但以上推測還需以獲得的轉基因果實為試材進行一系列的生理學、蛋白組學驗證。

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