楊樹菇培養(yǎng)料中農(nóng)藥消解動態(tài)分析

王 龍 張 鐸 王生榮 王秉峰 趙玉卉 高靜梅 秦 鵬

（1甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

楊樹菇（Agrocybe aegerita），別名茶薪菇，是近年來我國開發(fā)利用的一種珍稀食藥用蕈菌（章道忠和畢志樹，1991）。培養(yǎng)料是楊樹菇生長的重要基質(zhì)載體，若是培養(yǎng)料受到農(nóng)藥污染，這些污染物就會通過楊樹菇子實體的吸附而殘存于子實體中，子實體作為可食用的部分，它的品質(zhì)直接影響到人們的身體健康（黃年來，1993；楊月明和李美良，2003）。因此，楊樹菇中農(nóng)藥殘留限量（MRL）超標(biāo)問題日益受到國內(nèi)外的重視。我國現(xiàn)有的食用蕈菌國家標(biāo)準(zhǔn)中，僅對六六六、滴滴涕作出了要求，最高殘留限量均為0.1mg·kg-1。而通常也僅限于環(huán)境中（水、土壤等）農(nóng)藥殘留的調(diào)查研究，而對于食用蕈菌子實體及培養(yǎng)料中農(nóng)藥消解動態(tài)分析研究報道較少（門殿英 等，2004）。同時針對楊樹菇中農(nóng)藥殘留的研究也尚未見報道。所以，建立楊樹菇培養(yǎng)料農(nóng)藥殘留的檢測方法，進行培養(yǎng)料農(nóng)藥消解動態(tài)的研究，為保障楊樹菇的食品安全提供科學(xué)依據(jù)是非常必要的。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agitent6890N氣相色譜儀（美國Agilent公司），配63Ni-ECD檢測器；組織搗碎機DS-1型（上海標(biāo)本模型廠）；旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀 ZFQ-3型（上海亞榮生化儀器廠）；超聲波清洗器KQ-250D型（北京天鵬有限公司）；恒溫水浴振蕩器SHZ-88型；旋渦混合器WH-851；層析柱等各種玻璃器皿。

丙酮、正己烷、乙腈、氯化鈉、活性碳均為分析純；硅膠（農(nóng)殘級，使用前130 ℃活化2h，用5 %的蒸餾水降活使用）；中性氧化鋁（農(nóng)殘級，550 ℃灼燒4h，后130 ℃下烘3 h，3%蒸餾水降活使用）；弗羅里硅土（農(nóng)殘級，130 ℃活化3 h，用2 %蒸餾水降活使用）；六六六（α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC）、滴滴涕（o，p' -DDT、p，p' -DDT、p，p' -DDD、p，p' -DDE）、溴氰菊酯、氯氰菊酯、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)樣品純度均高于99 %（標(biāo)準(zhǔn)品由國家標(biāo)物中心提供）。

1.2 楊樹菇培養(yǎng)料配方

楊樹菇栽培種培養(yǎng)料（質(zhì)量比）：棉籽殼38.0 %，木屑30.0 %，麥麩18.0 %，玉米粉8.0 %，豆餅3.0 %，茶葉0.5 %，石膏粉1.0 %，紅糖0.5 %，磷酸氫二鉀0.5 %，磷酸二銨0.5 %，水60.0%～65.0 %（路等學(xué) 等，2005）。

1.3 試驗設(shè)計

設(shè)5種藥劑和空白處理（CK），每種藥劑混拌楊樹菇培養(yǎng)料12kg，分裝入4個包裝袋，用藥劑量（g·kg-1）：六六六0.3、滴滴涕0.3、毒死蜱1.0、溴氰菊酯3.0、氯氰菊酯3.0。

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品采集 分別于施藥后0、2、4、6、10、14、20、25、30、40d，隨機采樣，采用四分法最終采集楊樹菇培養(yǎng)料1000.0 g，空白處理采集空白樣品，均置于-20 ℃冰箱貯存待測。

1.4.2 樣品提取 準(zhǔn)確稱取3.0 g（DW）培養(yǎng)料置于三角瓶中，分別加入30mL蒸餾水和30mL乙腈，手動搖勻后立即放入恒溫水浴振蕩器中，在水浴溫度為30 ℃和轉(zhuǎn)速160 r·min-1下，振蕩提取2h。將提取液經(jīng)漏斗過濾于裝有7.0～10.0 g氯化鈉的100mL具塞量筒中，殘渣用5mL等體積乙腈/蒸餾水沖洗3次，收集所有濾液。在室溫下靜置分層，吸取一定體積提取液于250mL的圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃水浴下減壓濃縮至近干，待柱凈化（邵俊杰，1998）。

1.4.3 樣品凈化 玻璃層析柱中由上到下依次裝入5.0 g無水硫酸鈉、2.5g弗羅里硅土、1.0 g助濾劑545、2.0 g無水硫酸鈉和玻璃棉。先用10mL正己烷預(yù)淋洗層析柱，棄掉洗脫液。然后用正己烷∶丙酮=8.5 V∶1.5 V的混合洗脫液分別以10、20、20mL分3次洗圓底燒瓶，將洗液全部轉(zhuǎn)移到玻璃層析柱上，再用70mL混合洗脫液淋洗，收集全部洗脫液。

在35 ℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)近干。用正己烷∶丙酮=7 V∶3 V混合溶液將圓底燒瓶中的殘留農(nóng)藥轉(zhuǎn)移，用正己烷定容1mL，氣相色譜測定（申繼忠，1998）。

1.5 色譜條件

Agitent6890NGC，μ-ECD檢測器；HP-5毛細管柱30m×0.32mm×0.25 μm；高純氮氣（純度＞99.999 %）為載氣，柱流速1.5mL·min-1；進樣口溫度為250 ℃；檢測器溫度為280 ℃；柱前壓為72 psi，尾吹60mL·min-1；柱升溫程序為初始柱溫80 ℃，恒溫3min后，以10 ℃·min-1的速率升溫至160 ℃，恒溫5min后，以4 ℃·min-1的速率升溫至250 ℃，恒溫1min后，再以4 ℃·min-1的速率升溫至270 ℃，恒溫15min。采用不分流進樣方式，進樣量為 1.0μL（Beltran et al.，2003；Papadakis et al.，2006）。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)工作儲備液的配制

配制0.2mg·L-1的六六六、滴滴涕的各4種異構(gòu)體8種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，100mg·L-1毒死蜱、溴氰菊酯和氯氰菊酯3種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。經(jīng)正己烷溶液稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化條件的選擇

試驗分別對硅膠層析柱、中性氧化鋁層析柱和弗羅里硅土層析柱凈化效果進行了比較。用正己烷∶丙酮=15 V∶85 V混合淋洗液淋洗，測定各農(nóng)藥的添加回收率。硅膠層析柱凈化效果不理想，氯氰菊酯、o，p' –DDT、p，p' -DDT處有較多的干擾雜質(zhì)，而且毒死蜱的回收率偏低；中性氧化鋁層析柱凈化農(nóng)藥時，毒死蜱、p，p' -DDT、o，p' -DDT均有少量雜質(zhì)干擾；采用弗羅里硅土層析柱凈化時，各種農(nóng)藥的回收率均在 80 %以上，且分離效果較好（圖 1）。綜上，最終確定凈化條件為弗羅里硅土層析柱凈化。

圖1 5種農(nóng)藥氣相色譜圖

農(nóng)藥保留時間：α-BHC，13.221min；β-BHC，14.409min；γ-BHC，14.495min；δ-BHC，15.790min；p，p' –DDE，25.221min；p，p' –DDD，25.561min；o，p' –DDT，27.176min；p，p' –DDT，28.810min；毒死蜱，20.785min；氯氰菊酯，37.848min；溴氰菊酯，41.934min。

2.2 線性關(guān)系

將六六六、滴滴涕的4種異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液和毒死蜱、溴氰菊酯、氯氰菊酯的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)正己烷溶液稀釋配制成1.0、0.5、0.1、0.05、0.025、0.01mg·kg-1濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述色譜條件測定，得到色譜圖及相應(yīng)農(nóng)藥的回歸方程。結(jié)果表明α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、p，p' -DDE、p，p' -DDD、o，p' -DDT、p，p'-DDT 、毒死蜱、溴氰菊酯和氯氰菊酯在0.01～1mg·kg-1范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)≥0.9954，可以滿足定量分析的需要（表1、2）。

2.3 最小檢出量和最低檢出濃度測定

在所設(shè)定的儀器條件下，各種農(nóng)藥的最小進樣量峰高為噪聲3倍時，為最小檢出量。培養(yǎng)料樣品稱取3.0 g（DW），經(jīng)提取、凈化、定容1.0mL，氣相色譜測定，進樣量1μL，計算樣品的最小檢出量和最低檢出濃度：Cmin=（M×V1）/V2×m。Cmin，樣品最低檢出濃度，單位 mg·kg-1；M，農(nóng)藥的最小檢出量，單位 g；V1，樣品定容體積，單位 mL；V2：樣品溶液進樣體積，單位μL；m：樣品質(zhì)量，單位g（吳文君 等，2008）。

表1 混合農(nóng)藥的進樣濃度與峰面積（uv.s）

表2 農(nóng)藥回歸方程和相關(guān)系數(shù)

由表3可知，檢測出5種農(nóng)藥最小檢出量為2.8×10-10～1.6×10-8g，最小檢出濃度為0.00015～0.05300mg·kg-1。

表3 培養(yǎng)料中農(nóng)藥的最小檢出量和檢出濃度

2.4 培養(yǎng)料中5種農(nóng)藥消解動態(tài)測定

利用已建立的農(nóng)藥多殘留檢測方法分別對楊樹菇培養(yǎng)料中農(nóng)藥的消解動態(tài)進行檢測分析，得出農(nóng)藥的消解動力方程和半衰期。六六六、滴滴涕、毒死蜱、溴氰菊酯、氯氰菊酯5種農(nóng)藥在楊樹菇培養(yǎng)料中的半衰期分別為33.02、53.14、18.21、18.16、9.40d。分析檢測結(jié)果和消解動態(tài)方程見表4，消解動態(tài)曲線見圖2。

農(nóng)藥降解模式可用一級反應(yīng)動力方程式：C=C0e-KT。C為農(nóng)藥在 t時刻的殘留量，單位mg·kg-1；C0為農(nóng)藥的初始濃度，單位 mg·kg-1；K為降解速率常數(shù)；T為降解時間，單位d。農(nóng)藥殘留量計算公式：R=（Q×V終）/（V樣×W）。Q為從標(biāo)準(zhǔn)樣曲線上查得的相應(yīng)農(nóng)藥量（ng），V終為樣品溶液最終定容體積（mL），V樣為進樣體積（μL），W為稱樣量（g）（趙善歡，1998；吳文君和羅萬春，2008）。

圖2 楊樹菇培養(yǎng)料中農(nóng)藥消解動態(tài)曲線

表4 藥劑處理后楊樹菇培養(yǎng)料中農(nóng)藥消解動態(tài)

3 結(jié)論

本試驗利用氣相色譜法，針對楊樹菇培養(yǎng)料中六六六、滴滴涕、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯5種農(nóng)藥的殘留及其消解動態(tài)進行了檢測分析。檢測出5種農(nóng)藥最小檢出量為2.8×10-10～1.6×10-8g，最小檢出濃度為0.00015～0.05300mg·kg-1，相關(guān)系數(shù)≥0.9954；5種農(nóng)藥在楊樹菇培養(yǎng)料中的半衰期分別為：33.02、53.14、18.21、18.16、9.40d。該方法的靈敏度、精確度和準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留分析方法的要求（農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，1995；武漢大學(xué)，2000），對于我國食用菌中農(nóng)藥殘留的檢測具有一定的使用價值。此外，本測試分析只是對楊樹菇培養(yǎng)料中的 5種農(nóng)藥殘留檢測方法進行了研究，這些檢測方法是否可以運用到其他食用菌培養(yǎng)料農(nóng)藥殘留檢測上還有待于進一步試驗。

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