白藜三醇對兔心肌梗死后血管新生的誘導作用＊

馬潔，周召鋒，徐晤，張超群，張卓琦，王志榮

心肌梗死是當今社會威脅人類健康，致死致殘的主要原因，其傳統治療方法如溶栓、血管成形術、外科搭橋術都有相應的局限性［1］。慢性冠狀動脈閉塞已經展示了對側支動脈發展的誘導，其重建使得主要血流通過微血管或血管再生流向瀕死心肌。近十幾年來研究發現白藜三醇具有抗炎、抗氧化及明確的心血管系統的保護作用，包括縮小梗死面積［2］。白藜三醇是一種黃體酮類多酚單體化合物，它能否促進血管生成尚不清楚。本研究擬建立兔心肌梗死模型，觀察白藜三醇慢性給藥對心肌梗死后血管新生、冠狀動脈側支循環形成、梗死面積的影響，并進一步探討其作用及機制。

1 材料與方法

實驗動物:我們于2010-03至2010-08選擇新西蘭大耳白兔(雌雄不拘)32只，體重(2500±50)g，由徐州醫學院動物中心提供。試劑:白藜三醇(湖南洪江華光生物有限責任公司)，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和細胞表面的唾液粘蛋白(CD34)一抗(北京博奧森生物技術有限公司)，血管內皮生長因子-A(VEGF-A)一抗(美國，millipore公司)，反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(美國，promega公司)，免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

實驗分組及動物模型的建立:32只新西蘭白兔隨機分為假手術組、手術對照組、白藜三醇組、消心痛組，每組8只。假手術組中左冠狀動脈前降支(LAD)僅穿線不結扎，其余三組兔于左心房下緣1～2cm處結扎左前降支建立急性心肌梗死模型，術后青霉素鈉80萬單位肌注3天。

術后藥物干預及取材:假手術組及手術對照組予7%酒精3ml，白藜三醇組予白藜三醇3mg/kg(溶于7%酒精3ml)，消心痛組予消心痛2.4mg/kg(溶于7%酒精3ml)，均灌胃，1次/天。2周后，取存活兔心臟，石蠟包埋、切片;留取梗死邊緣區組織－80℃保存。

指標檢測:4組白兔均經以下5種指標檢測，①蘇木精—伊紅染色法(HE染色)及馬松三色染色法(Masson染色)檢測梗死區、非梗死區心肌病理變化:應用image pro plus 6.0圖像分析軟件，參照 Litwin等［3］的方法計算心肌梗死面積。②梗死邊緣區微血管密度的檢測:梗死周邊2mm界定為梗死邊緣區［2］。免疫組化法檢測梗死邊緣區CD34抗原，采用文獻中所述方法［4］，以 CD34標記計數微血管密度(MVD)。③免疫組化化學染色定量分析各組梗死邊緣區微血管密度及IGF-1、bFGF的表達:將IGF-1及bFGF染色后的切片，應用顯微鏡在相同光源強度下，于400×視野每張切片隨機選取梗死邊緣區5個視野的圖像，待資料匯總后，通過image pro plus圖像分析軟件檢測其平均光密度值(optical density，OD)。④western-blot測定各組梗死邊緣區心肌IGF-1、b FGF、VEGF-A的蛋白表達:以每個樣品的總蛋白為100 μg上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至硝酸纖維素膜上，一抗(IGF-11∶100，b-FGF 1 ∶50，VEGF-A 1 ∶1000)封閉 4℃過夜，二抗(1∶100)37℃孵育1 h，紅外熒光顯色。ImageJ圖像分析儀進行半定量分析。⑤RT-PCR測定各組梗死邊緣區VEGF-A的mRNA的表達:以GeneBank中目的基因序列為模板設計引物，序列如下:VEGF-A上游引物5’GGG CTC ATG GAC GGG TGA GG3’，下游引物5’TCA CCG CCT CGG CTT GTC AC3’;β-actin 上游引物5’CTA CGA GGG CTA CGC GCT GC3’，下游引物5’CGA GAG AGG GTG TCC CGC CA3’(引物由上海Invitrogen生物公司合成)。RT反應條件:室溫10 min，45℃ 50 min，94℃ 5 min，0℃ 10 min;PCR 反應條件:94℃ 5 min 預變性;94℃ 1 min，57℃ 1 min，68℃1 min共40個循環;終末延伸68℃ 7 min。取RT-PCR反應產物4 μl于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像掃描及分析系統，測定目的基因與內參基因的積分吸光度比值。

統計學處理:計量數據采用均數±標準差表示，SPSS13.0統計軟件進行統計學處理。分別行方差齊性檢驗、單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

一般情況:27只動物存活至治療結束，總存活率為84.4%(27/32)。

手術對照組，白藜三醇組，消心痛組HE染色及Masson染色:HE染色可見未梗死部位的心肌細胞排列整齊緊密，肌纖維走向明晰，細胞分界清楚，胞核橢圓形位于中央，胞質呈嗜酸性均勻染色，而梗死區室壁變薄，外膜至內膜間心肌纖維數量減少，肉芽組織、纖維組織和脂肪組織增生明顯，各種細胞排列紊亂，少量散在的心肌細胞。Masson染色梗死部位纖維結締組織呈藍色，正常心肌纖維呈紫紅色或深紅色。

心肌梗死面積及梗死邊緣區微血管密度測算:依據HE、Masson染色結果，手術對照組、白藜三醇組及消心痛組梗死邊緣區微血管密度較假手術組明顯增加(P＜0.05)，白藜三醇組及消心痛組較手術對照組明顯增加(P＜0.05)，差異均有統計學意義;白藜三醇組與消心痛組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。白藜三醇組及消心痛組心肌梗死面積明顯低于手術對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，而白藜三醇組與消心痛組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。(表1)

表1 各組心肌梗死面積及梗死邊緣區微血管密度比較()

表1 各組心肌梗死面積及梗死邊緣區微血管密度比較()

注:與假手術組比較*P＜0.05;與手術對照組比較△P＜0.05

組別 例數 心肌梗死面積(%)梗死邊緣區微血管密度(個)假手術組8.31±2.51手術對照組 6 33.81±3.76 13.32±2.75*白藜三醇組 7 22.82±4.10△ 25.15±3.74＊△消心痛組 7 23.08±3.69△ 24.54±2.577 0＊△

VEGF-A、IGF-1及bFGF表達情況:白藜三醇組、消心痛組較假手術組、手術對照組能明顯增加VEGFA(蛋白及mRNA 表達)、IGF-1(OD，蛋白表達)、bFGF(OD，蛋白表達)的表達(P＜0.05)，差異均有統計學意義;手術對照組較假手術組VEGF-A(蛋白及mRNA表達)、IGF-1(OD，蛋白表達)表達增加(P ＜0.05)，差異均有統計學意義，但bFGF表達兩組之間差異無統計學意義(P＞0.05);消心痛組IGF-1(OD，蛋白表達)的表達水平較白藜三醇組明顯降低(P＜0.05)，差異有統計學意義，VEGF-A、bFGF兩組之間差異無統計學意義(P＞0.05)(western-blot與RT-PCR所測VEGF-A結果相一致;western-blot與免疫組化化學染色法所測IGF-1、bFGF 結果相一致)。(圖 1，圖 2，表2)

圖1 各組心肌IGF-1、bFGF蛋白表達 IGF-1:胰島素樣生長因子-1 bFGF:堿性成纖維細胞生長因子 β-actin:β-肌動蛋白。1:假手術組(7例)2:手術對照組(6例)3:白藜三醇組(7例)4:消心痛組(7例)

圖2 各組VEGF-A的mRNA及蛋白表達圖2A為mRNA表達圖2B為蛋白表達。VEGF-A:血管內皮生長因子-A β-actin:β-肌動蛋白 mRNA:信使核糖核酸 DNA marker:脫氧核糖核酸分子標記。除手術對照組樣本數為6例，其余均為7例

表2 各組梗死邊緣區胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子-A的表達量比較()

表2 各組梗死邊緣區胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子-A的表達量比較()

注:與假手術組比較*P＜0.05;與手術對照組比較△P＜0.05;與白藜三醇組比較▲P＜0.05。IGF-1:胰島素樣生長因子-1 bFGF:堿性成纖維細胞生長因子 VEGF-A:血管內皮生長因子-A OD:光密度值

假手術組(n=7) 手術對照組(n=6) 白藜三醇組(n=7) 消心痛組(n=7)IGF-1(OD) 0.0029±0.0030 0.0199±0.0088* 0.1506±0.0557＊△ 0.0829±0.0243＊△▲IGF-1(蛋白表達) 0.1171±0.0916 0.3701±0.0778* 1.2062±0.2495＊△ 0.6671±0.0716＊△▲bFGF(OD) 0.0082±0.0089 0.0367±0.0464 0.0928±0.0341＊△ 0.0934±0.0459＊△bFGF(蛋白表達) 0.2884±0.0748 0.4160±0.1481 0.8663±0.1562＊△ 0.8961±0.1075＊△VEGF-A(蛋白表達) 0.6508±0.0762 0.9225±0.0642* 1.2314±0.0556＊△ 1.2259±0.0752＊△VEGF-A(mRNA表達) 0.5491±0.0171 0.7452±0.0361* 1.0169±0.0604＊△ 0.8898±0.0419＊△

3 討論

臨床研究證明，靠機體啟動再生新的血管以適應缺血變化的過程非常緩慢，因此，在血管成形術、外科搭橋術不能奏效的時候，人為地增加心肌局部生長因子的濃度，對緩解以致解除心肌缺血有潛在的可行性。有人在大鼠的心肌及后肢肌缺血等模型中，應用生長因子進行實驗性治療，結果表明，缺血的骨骼肌可建立大量的側支循環;在心肌中，微血管密度增加，引起冠狀動脈血流量的增加，梗死面積的顯著縮小及心功能的明顯改善。心肌梗死后冠狀動脈原有側支開放的程度有限，不足以代償機體的需要，而血管新生促側支循環形成則有重要意義。良好的側支循環在減少心肌缺血和梗死的范圍、保護存活心肌、抑制心肌細胞凋亡、改善心肌重構和心功能有著積極的作用。我們的前期工作發現，消心痛和白藜三醇均可以開通急性心肌梗死的側支循環。

消心痛作為硝酸酯類藥物是外源性一氧化氮供體，其作為臨床上對冠心病患者傳統藥物的應用，能明顯改善患者心肌缺血的癥狀。既往有許多研究表明，新生血管的形成與一氧化氮合酶—一氧化氮系統的關系密切。有研究表明eNOS轉基因治療可減少大鼠心肌梗死的面積，其機制可能與激活TGF-β/Samd2信號通路、增加血管生成有關［5］。我們的研究發現，兔急性心肌梗死后，消心痛喂養兩周可明顯減少心肌梗死面積，增加心肌缺血區微血管的密度，其機制可能涉及消心痛體內轉化為一氧化氮，促進多種生長因子的直接或間接表達增加。

范虞琪［6］報道了白藜三醇對動脈粥樣硬化的預防作用及直接擴張血管作用。Kaga等［2］研究發現白藜三醇在體外試驗中可促進人冠狀動脈內皮細胞形成管腔形態，在活體試驗中給予白藜三醇預處理可減少大鼠心肌梗死面積。有個別報道證實白藜三醇在心肌缺血再灌注方面保護心臟［7］。諸多研究證實，白藜三醇是一個有希望抵抗冠心病，多方面保護心臟的物質。本文首先建立兔心肌梗死模型，然后予包括白藜三醇等不同的藥物干預，兩周后證實心肌梗死后應用白藜三醇可以減少心肌梗死面積，增加微血管密度，誘導心肌梗死后IGF-1、bFGF、VEGF-A的表達，且與手術對照組相比，差異具有統計學意義。其中，IGF-1差異最為顯著，較消心痛組明顯增加，差異具有統計學意義，說明其機制可能與硝酸脂類促血管生成作用有所不同。近年來對IGF-1的研究提示，IGF-1對內皮功能的改善可以通過與內皮存在高親和力位點并與之相互作用產生一氧化氮［8］并通過抗細胞凋亡和抗炎作用來抵抗內皮功能障礙。通過介導血管舒張［9］來調整血管緊張度和動脈血壓，同時保存冠狀動脈血流儲備［10］。在內皮細胞和血管平滑肌細胞上，IGF-1可以通過酪氨酸激酶膜受體與胰島素受體1和2的結合并相互作用增加一氧化氮合酶的活性［11］，并持續、緩慢釋放一氧化氮，增加血管舒張。有實驗證實IGF-1能提高缺血的預處理，并通過其抗細胞凋亡和鉀離子通道的開放來減少缺血損傷［12］;IGF-1在小鼠身上的超表達能保護心肌梗死后的心肌細胞，減少心肌細胞的死亡，并減弱心室壁的壓力，減緩心室的擴張及肥大，并能抵抗非梗塞冠狀動脈的收縮對心臟造成的損害［13］。因此，結合本實驗結果，白藜三醇誘導血管發生與多種血管生長因子表達增多相關，有利于側支循環的進一步形成，其對心血管系統的保護作用主要與介導IGF-1的高表達相關。

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