胰島素改善糖尿病小鼠骨髓內皮祖細胞動員障礙研究*

董莉，徐標，康麗娜，丁亮，陳琴，高玲

血管內皮功能異常、組織缺血后側支血管形成障礙是糖尿病患者易患血管閉塞性疾病的重要機制。近年來的研究顯示，缺血組織的血管新生及側支血管形成不僅依賴于成熟血管內皮細胞的分裂增殖，循環中骨髓起源的內皮祖細胞(EPC)也積極參與了這一過程。內源性缺血損傷或者應用細胞因子及藥物能夠動員骨髓中的干細胞和EPC至外周血，進而參與內皮修復及血管新生［1，2］。血管內皮生長因子(VEGF)/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶以及間充質衍生因子1α(SDF-1α)/基質金屬蛋白酶-9信號通路在EPC動員過程中發揮重要作用［3，4］。研究也發現糖尿病個體循環中EPC數量減少、治療性血管新生呈現反應缺陷［5］。我們先前的研究顯示糖尿病患者及糖尿病動物組織缺血后骨髓EPC向外周血動員明顯減少［6］，本研究的主要目的就是進一步探討骨髓EPC動員障礙的可能機制，并觀察胰島素治療能否改善這種障礙。

1 材料與方法

糖尿病模型的建立:2007-12至2009-05選取C57BL/6小鼠(南京大學模式動物研究所)8周齡，96只，體重(25.1±1.2)g。參照文獻［6］腹腔注射鏈脲霉素(美國sigma公司)建立糖尿病模型。隨機分為糖尿病組和糖尿病胰島素治療組(胰島素組)，胰島素組術前及術后注射胰島素以糾正高血糖［5］。另取非糖尿病組作對照(各組n=32)。

后肢缺血模型的建立:入組小鼠飼養2個月后，參照文獻［6］行左側股動脈及其大分支結扎離斷術，術后通過血管造影及紅四氮唑(南京國藥集團)染色評估手術效果，確定單側后肢缺血模型造模成功。

骨髓及外周血單個核細胞分離:于術前及術后不同時間(0、1、3、7 天)采血，利用 Histopaque-1083 密度梯度離心獲取外周血單個核細胞。以外科手法暴露股骨及脛腓骨，定量沖洗骨髓，離心后分離上清及骨髓細胞。

外周血早期EPC檢測:參照文獻［6］，重懸外周血單個核細胞，分別加入異硫氰酸熒光素標記的大鼠抗小鼠干細胞抗原1(Sca-1)單克隆抗體、藻紅蛋白-花青苷5標記的大鼠抗小鼠干細胞因子受體(c-Kit)單克隆抗體、藻紅蛋白標記的大鼠抗小鼠胎肝激酶1(Flk-1)單克隆抗體3種小鼠早期EPC表面標記抗體或同型對照(美國eBioscience公司)，4℃避光孵育，孵育結束后采用美國BD公司FACS Calibur流式細胞儀檢測，用 Cell Quest軟件分析外周血單個核細胞中c-Kit+/Sca-1+/Flk-1+細胞比例，代表外周血早期EPC水平。

血漿及骨髓VEGF、SDF-1α水平測定:酶聯免疫吸附法測定血漿及骨髓中VEGF、SDF-1α水平，操作按照檢測試劑盒(美國R＆D公司)說明書進行。

骨髓細胞VEGF、蛋白激酶B、內皮型一氧化氮合酶及基質金屬蛋白酶-9蛋白及其磷酸化產物測定:參照文獻［7］，免疫印跡法測定骨髓細胞中上述蛋白表達水平［羊抗小鼠 VEGF多克隆抗體1:400(美國Santa Cruz公司)，兔抗小鼠蛋白激酶B及其磷酸化單克隆抗體1:2000(美國Eptomics公司)，小鼠抗小鼠內皮型一氧化氮合酶及其磷酸化單克隆抗體1:500(美國BD公司)，兔抗小鼠基質金屬蛋白酶-9多克隆抗體1:15000(英國Abcam公司)，小鼠抗小鼠β-肌動蛋白單克隆抗體1:5000(美國BioVision公司)］。用Quantity One圖象分析軟件(美國BIO-RAD公司)分析，將待測蛋白條帶與同一泳道β-肌動蛋白條帶光密度比值作為結果。

骨髓基質金屬蛋白酶-9酶活性測定:參照文獻［7］，明膠酶譜法測定骨髓上清基質金屬蛋白酶-9酶活性。利用Quantity One圖象分析軟件分析酶水解條帶反轉后的光密度值，作為酶活性強度。

統計學分析:應用SPASS11.0軟件進行統計學分析，計量數據用x表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較再用Bonferroni檢驗。兩個連續變量之間的相關性分析采用Pearson線性相關。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

小鼠基本生理情況:試驗前小鼠體重、血糖3組間比較差異均無統計學意義。體重:手術前糖尿病組較非糖尿病組減低(P＜0.01)，手術前胰島素組較非糖尿病組減低(P＜0.01);處死前糖尿病組較非糖尿病組減低，胰島素組較糖尿病組升高(P＜0.01)，差異均有統計學意義。血糖:手術前糖尿病組較非糖尿病組升高(P＜0.01)，手術前胰島素組較非糖尿病組升高(P＜0.01);處死前糖尿病組較非糖尿病組升高(P＜0.01)，胰島素組較糖尿病組下降(P＜ 0.01)，差異均有統計學意義。(表1)

表1 3組小鼠基本生理情況比較(n=32， x)

表1 3組小鼠基本生理情況比較(n=32， x)

注:與非糖尿病組比較*P＜0.01;與糖尿病組比較ΔP＜0.01

體重(g)血糖(mmol/L)組別試驗前 手術前 處死前非糖尿病組 25.0 ±1.1 31.5 ±2.5 29.6 ±2.0 6.7 ±0.9 6.7 ±1.6 6試驗前 手術前 處死前.8 ±1.5糖尿病組 25.2 ±1.3 26.2 ±1.5* 23.3 ±2.3* 6.7 ±1.1 20.4 ±2.3* 20.5 ±2.8*胰島素組 25.1 ±1.2 25.9 ±1.7* 26.9 ±1.8Δ 6.8 ±0.6 19.9 ±2.5* 7.9 ±1.9Δ

缺血后不同時間外周血EPC數量變化情況(6次實驗結果):3組不同時間外周血EPC流式細胞儀檢測，術后3天外周血 EPC水平在非糖尿病組為2.98%，糖尿病組為0.97%，胰島素組為1.98%。由圖1可見，與術后0天比較，非糖尿病組術后1、3天外周血EPC數量增加(P＜0.01)，胰島素組術后3、7天外周血EPC數量增加(P＜0.01)，差異均有統計學意義。組間比較:術后0、1、3、7天糖尿病組與非糖尿病組比較外周血EPC數量減少(P＜0.01)，術后3、7天胰島素組與糖尿病組比較外周血EPC數量增加(P＜0.01)，差異均有統計學意義。

圖1 術后不同時間各組外周血內皮細胞數量變化情況 與術后0天比較?P＜0.01(n=6);與非糖尿病組比較*P＜0.01;與糖尿病組比較#P＜0.01。c-Kit:干細胞因子受體 Sca-1:干細胞抗原-1 Flk-1:胎肝激酶-1 PBMCs:外周血單個核細胞

胰島素治療改善糖尿病小鼠缺血誘導的血漿VEGF及SDF-1α釋放抑制:與外周血骨髓EPC動員的變化趨勢一致，高峰期糖尿病組血漿VEGF及SDF-1α釋放水平較非糖尿病組明顯減低［VEGF:(85±12)pg/ml比(164 ±15)pg/ml，P ＜0.01;SDF-1α:(731±26)pg/ml比(1267 ±87)pg/ml，P ＜0.01］;胰島素組血漿VEGF及SDF-1α釋放水平較糖尿病組分別增加1.6及1.3倍［VEGF:(139±19)pg/ml比(85±12)pg/ml，P ＜0.01;SDF-1α:(972 ±40)pg/ml比(731 ±26)pg/ml，P ＜0.01］，差異均有統計學意義。

胰島素治療改善糖尿病小鼠骨髓動員相關信號通路的活化障礙:術后3天時，糖尿病組缺血誘導的骨髓SDF-1α及VEGF釋放水平較非糖尿病組明顯減低［SDF-1α:(920±118)pg/ml比(1800±124)pg/ml，P ＜0.05;VEGF:(91 ±12)pg/ml比(223 ± 21)pg/ml，P ＜0.05］;蛋白免疫印跡檢測結果顯示，糖尿病組缺血術后骨髓細胞VEGF上調受抑制，且蛋白激酶B及內皮型一氧化氮合酶磷酸化水平較非糖尿病組明顯減弱［VEGF:(0.18 ±0.06)比(0.45 ±0.07)，P ＜0.05;磷酸化蛋白激酶 B:(0.22 ±0.07)比(0.75 ±0.05)，P ＜0.05;磷酸化內皮型一氧化氮合酶:(0.50 ±0.07)比(1.45 ±0.25)，P ＜0.05］;此外，糖尿病組缺血誘導的基質金屬蛋白酶-9蛋白表達及其酶活性較非糖尿病組明顯減低［基質金屬蛋白酶-9 蛋白水平:(0.27 ±0.06)比(0.88 ±0.07)，P＜0.05;酶活性/μg蛋白:(260 ±24)比(480 ±52)，P＜0.05］，差異均有統計學意義;單變量線性回歸分析表明，糖尿病組骨髓基質金屬蛋白酶-9酶活性受抑與其循環中 EPC水平減低相關(r=0.87，P＜0.01)。胰島素組缺血早期骨髓中SDF-1α及VEGF水平、骨髓細胞蛋白激酶B與內皮型一氧化氮合酶磷酸化水平及基質金屬蛋白酶-9酶活性較糖尿病組明顯增強(P＜0.05)，差異均有統計學意義。

3 討論

循環中的EPC可通過動員歸巢、分化增殖、遷移整合等機制參與各種生理及病理狀態下的成體血管新生［1，2］，因此，缺血損傷后骨髓EPC 向外周血動員障礙可能是阻礙糖尿病個體代償性血管新生及側支形成的重要原因。

然而影響糖尿病骨髓EPC動員的機制目前仍未清楚。本研究發現，糖尿病動物缺血早期SDF-1α及VEGF的上調顯著受抑制，并伴隨其骨髓組織下游信號分子活化障礙。組織缺血缺氧發生后，損傷部位缺氧誘導因子1α誘導VEGF及SDF-1α的表達與釋放。在骨髓組織中，增多的VEGF與骨髓細胞表面受體結合后進一步激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶/一氧化氮信號途徑，導致一氧化氮合成與釋放增加［3］。一氧化氮進而誘導活性基質金屬蛋白酶-9釋放，后者促進EPC在骨髓內募集并向外周血遷移［4］。SDF-1α亦可通過誘導蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶/基質金屬蛋白酶-9信號通路活化機制促進骨髓EPC動員、并歸巢至損傷部位參與組織血管修復［4，9］。然而糖尿病時生成增加的氧化代謝毒物和高血糖本身可阻礙上述信號通路級聯激活，導致一氧化氮生物利用度降低以及基質金屬蛋白酶-9失活［8］。因此，糖尿病狀態下缺血誘導的SDF-1α與VEGF信號通路活化受損可能是造成骨髓EPC向外周血動員障礙的重要機制之一。

Humpert等［9］報道，胰島素治療增加2型糖尿病患者循環中CD34+/133+內皮祖細胞水平，并且胰島素的這種動員作用受到SDF-1調控。同樣地，我們發現，胰島素治療有效促進糖尿病小鼠組織缺血后骨髓EPC動員;同時胰島素明顯提高實驗動物缺血誘導的血管活性因子SDF-1α及VEGF釋放水平、并促進骨髓動員相關信號通路級聯活化。這些功能改善一方面可能源于胰島素的直接誘導作用［10］，另一方面可能通過降低高血糖、減輕氧化應激，從而恢復缺氧敏感系統活化。因此，我們認為胰島素治療可能通過恢復缺血誘導的SDF-1α/VEGF相關信號通路活化機制，從而改善糖尿病小鼠骨髓EPC動員障礙。

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