索拉菲尼聯合華蟾素對離體肝癌細胞株SMMC-7721的協同抑制效應觀察

鄭培實，張 陽，蔣 葵，李英華，徐麗葉，方立萍，丁曉蕾

(大連醫科大學附屬第二醫院，遼寧大連 116023)

目前，對于晚期肝癌仍缺少有效的藥物治療方案[1]，以細胞信號傳導為理論基礎的靶向治療是近期研究熱點。研究證實，索拉非尼誘導肝癌細胞凋亡的機制之一是通過 RAF/MEK/ERK通路[2]，而華蟾素通過 FAS通路起到抗腫瘤作用[3]。但目前療效欠佳，其根本原因在于信號通路的交叉[4]。解決方案為發現不同通路的結點(即 Crosstalk)[5]和可能存在的信號增益。以此為理論基礎即可實現不同靶點藥物的合理聯合，又有可能深化信號傳導網絡的認識，并發現更多可以利用的結點。2009年 10月 ～2010年 4月，我們將索拉非尼聯合華蟾素作用于人肝癌 SMMC-7721細胞，探討兩藥聯合潛在的協同作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人肝癌 SMMC-7721細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。華蟾素注射劑，索拉非尼。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒。Mcl-1單克隆抗體，Tubulin多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG和羊抗兔 IgG，PVDF膜。RPMI1640培養液(含 10%胎牛血清、青鏈霉素各100 U/ml)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取人肝癌 SMMC-7721細胞，于37℃、5%CO2孵箱培養，細胞為上皮樣貼壁細胞，每 3 d傳代 1次。取對數生長期細胞用于試驗。

1.2.2 細胞干預及相關指標檢測 將對數生長期SMMC-7721細胞接種于 96孔板，密度為 7×103/孔，培養 24 h后分成四組，索拉非尼組予索拉非尼6.0μmol/L干預，華蟾素組予華蟾素 0.6μmol/L干預，聯合組予索拉非尼和華蟾素聯合干預(劑量同前)，對照組不做任何干預。各組均設 5個復孔，加藥分別培養 24、48 h后行以下指標檢測:①細胞增殖抑制率:各孔加 5%四氮唑藍液 10μl，孵育 4 h，洗滌后各孔加二甲基亞砜 200μl，充分混勻溶解，酶標儀測定波長 570 nm處的 D值，計算細胞增殖抑制率。抑制率(%)=(對照組 D值 -實驗組 D值)/對照組 D值 ×100%。②細胞凋亡率:離心去培養基，PBS洗滌后，采用 Annexin.V/PI雙標記的流式細胞術避光室溫標記30 min，流式細胞儀檢測。③Mcl-1 mRNA:加藥培養 48 h后收集細胞，提取細胞總 RNA，采用 RT-PCR法檢測。于 Light Cycler RT-PCR System儀上行定量 RT-PCR;結果以 Mcl-1拷貝數/GAPDH拷貝數計算 Mcl-1 mRNA的表達。④Mcl-1蛋白:加藥培養 48 h后收集細胞提取總蛋白，采用 Western blot法檢測。結果用 Leica Qwin圖像分析軟件進行條帶光密度積分值分析。

1.3 統計學方法 采用 SPSS11.5統計軟件。計量資料以±s表示。兩組間比較采用 F檢驗，多組間比較采用單因素方差分析;交互效應分析采用因子分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率 各組不同時間細胞增殖抑制率比較見表1。

表1 各組不同時間細胞增殖抑制率(%)

2.2 細胞凋亡率 華蟾素組 24、48 h后凋亡率分別為 3.27%、4.35%;索拉非尼組分別為 12.31%、4.62%;聯合組分別為 19.01%、7.33%，聯合組與單藥組比較明顯升高(P均 ＜0.05)。

2.3 Mcl-1 mRNA及蛋白表達 見表2。

表2 各組 Mcl-1 mRNA及蛋白表達(%)

3 討論

晚期肝癌缺少有效的治療手段，利用 RAF/MEK/ERK通路[5]或FAS通路[6]以促進腫瘤細胞凋亡是目前研究熱點。索拉非尼是第一個口服的多激酶抑制劑，作用機制之一即在于激活 RAF/MEK/ERK通路[6，7]。已有多項研究證實華蟾素對離體肝癌細胞具有抑制增殖和誘導凋亡作用，且其作用機制在于激活 FAS通路[8，9]。本研究結果表明索拉非尼單藥、華蟾素的單藥和聯合均能抑制 SMMC-7721細胞增殖，誘導其凋亡。統計學分析顯示兩藥聯合有交互效應，且為協同作用。這一結果提示索拉非尼與華蟾素聯用，可能取得較兩藥單用更好的療效。

為進一步闡明這種協同作用的分子機制，我們檢測了兩種藥物單獨作用及聯合作用情況下對Mcl-1蛋白及 mRNA表達的影響。結果表明聯合組的 Mcl-1蛋白表達水平最低;索拉菲尼使 Mcl-1 mRNA和蛋白表達均顯著下調，而華蟾素僅使 Mcl-1蛋白表達顯著降低，提示上述協同作用可能在于索拉菲尼放大了華蟾素作用下的 FAS通路的信號，而非相反。值得注意的是，盡管沒有統計學差異，但索拉菲尼下調 Mcl-1蛋白的程度確實大于華蟾素，說明索拉菲尼很可能發揮著獨立于 RAF/MEK/ERK通路的、引起了 Mcl-1蛋白降解增加的作用。鑒于已經證實的 Mcl-1蛋白的降解分子通路[10]，可印證索拉菲尼對于肝癌 SMMC-7721細胞的這一潛在作用在于對 Caspase-3的影響，與 Huber等[11]基于慢性淋巴細胞白血病的觀察中得出的結論相符。

為突破靶向治療療效欠佳的瓶頸問題，方案之一是更精確地了解受體表達情況(藥敏檢測)。但鑒于細胞信號傳導通路之間存在的交叉[4]，即使實現了一條通路的成功阻斷，信號也可以通過旁路傳導而使預計的療效無法實現。因此有理由認為:發現不同通路的結點來發揮有利的信號增益可能是另一種更可行的解決方案[5]。本研究結果證實索拉菲尼與華蟾素通過 RAF和 FAS雙通路干預及 Mcl-1這一結點發揮了協同抑制作用，機制在于索拉菲尼通過對華蟾素作用下 FAS通路的信號放大作用而上調了離體肝癌細胞的凋亡，這可以為上述藥物在臨床上的合理聯合提供理論基礎;另一方面表明索拉非尼可能具有影響肝癌細胞株 SMMC-7721的 Mcl-1蛋白降解能力，其上游事件值得進一步研究。

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