NIV毒素和硒對軟骨細胞CD44代謝的影響

曹珮華，曹峻嶺，曹勵民，楊亞娟，李蔚勃

(1西安醫學院檢驗教研室，西安 710021;2西安交通大學醫學院地方病研究所)

大骨節病(KBD)是一種原因不明的慢性、變形性、地方性骨關節病。真菌毒素中毒及缺硒是 KBD重要的病因學說[1]。CD44是軟骨細胞表面表達的一類信息分子，對于維持關節軟骨基質蛋白聚糖的代謝平衡及結構完整具有非常重要的作用。2009年，我們觀察了雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)毒素和硒缺乏對體外培養胎兒軟骨細胞 CD44表達的影響，旨在進一步探討 KBD的發病機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 NIV毒素(日本和光純藥工業株氏會社);Na2SeO3.5H2O(重慶俞州精細化工廠);DME/F-12培養基、胰蛋白酶 (Gibco);透明質酸酶、Ⅱ型膠原酶 (Sigma);Trizol(Invitrogen);反轉錄試劑盒和PCR試劑盒(Frementas);sCD44ELISA試劑盒(Genzyme);CD44單克隆抗體(博士德生物技術有限公司)。

1.2 細胞培養及干預 取 4月齡引產胎兒軟骨細胞進行原代分離、培養[2]，當軟骨細胞長成單層后，胰酶消化并進行傳代。按照 40萬個細胞/瓶接種于培養瓶后，置于 CO2培養箱 37℃培養。穩定 24 h后將細胞隨機分為四組:對照組不處理，加硒組加入硒質量濃度為 0.1 mg/L，雪腐鐮刀菌烯醇毒素(NIV)組加入 NIV毒素使終質量濃度為 0.1 mg/L，聯合組加硒和 NIV毒素，濃度同上。48 h換培養液1次，作用 5 d后，收集細胞培養液待檢。

1.3 CD44mRNA及 CD44蛋白檢測 CD44mRNA:檢測過程于冰面上操作。每個培養瓶中加入 1 ml Trizol裂解液，室溫靜置 5 min。加入 0.2 ml氯仿，震蕩混勻后離心。加入 0.5 ml異丙醇，室溫靜置 10 min。4℃離心后加入 75%乙醇 1 ml洗滌振蕩，4℃離心后將 RNA沉淀溶于 30μl DEPC中。取 6μl的RNA模板，分步加入 oligo-dT、RNA酶抑制劑、MMulV反轉錄酶等逆轉錄 cDNA鏈。采用 25μl PCR反應體系擴增目的基因雙鏈，預變性:94℃ 2 min;變性:94℃ 30 s;退火:65℃ 1 min;延伸:70℃ 2 min;40個循環后 70℃再延伸 7 min。2%瓊脂糖凝膠 80 V電壓，電泳 45 min。經凝膠圖像采集系統分析，根據 CD44條帶與 GAPDH條帶的灰度比值，為目的基因表達的半定量。CD44蛋白:收集各組培養細胞，除對照組外，加入 FITC-CD44抗體 (10 μl/管 )，37℃避光孵育 30 min;1 500 r/min離心 10 min，離心 2次。棄上清，加入 500μl PBS混勻，用單色激光在488 nm發射光激活細胞進行檢測，計算陽性率(%)。

1.4 細胞培養液中可溶性 CD44(sCD44)濃度檢測

除空白孔外，分別將不同濃度標準品或細胞培養液(100μl/孔)加入相應孔中 ，室溫孵育 60 min，洗板。除空白孔外，加入第一抗體工作液(50μl/孔)，室溫孵育 30 min，洗板。除空白孔外，加入酶標抗體工作液(100 μl/孔 )，室溫孵育 30 min，洗板 。加入底物工作液(100μl/孔)，避光室溫孵育 20 min。加入終止液，測量 OD450值。將所測 sCD44的 OD值減去空白的 OD值，制作標準曲線，查出濃度值。

1.5 統計學方法 采用 SPSS13.0統計軟件。各組計量數據以±s表示，組間比較采用 t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組軟骨細胞 CD44mRNA及蛋白表達 見表1。

表1 各組軟骨細胞 CD 44 mRNA及蛋白表達

2.2 各組培養液中 sCD44表達 聯合組培養液中sCD44為 (40.35±8.23)μg/L，HIV組為(43.53±9.36)μg/L，加硒組為 (29.18 ±4.85)μg/L，對照組為(27.44±6.13)μg/L，對照組與其他三組比較，P＜0.05;聯合組與 HIV組比較，P＜0.05。

3 討論

NIV是由多種鐮刀菌產生的一種真菌毒素，主要污染糧谷物及其制品，在 KBD區檢測糧食時發現NIV毒素污染率明顯高于非病區[3]。研究表明，NIV毒素可阻礙軟骨細胞的分裂和增殖，引起軟骨生物化學代謝障礙，導致關節軟骨壞死[4]。因而KBD可能與 NIV毒素具有一定的相關性。KBD是骨關節病和軟骨疾患較為特殊的類型，最主要的病理變化是關節軟骨的變性壞死，軟骨基質代謝紊亂。軟骨細胞外基質的主要成分之一是蛋白聚糖，蛋白聚糖聚合物通常是由 100條蛋白聚糖單體經連接蛋白結合在透明質酸(HA)長鏈的兩側而形成。而CD44作為胞膜和基質 HA受體可以影響 HA的代謝，繼而影響到軟骨基質蛋白聚糖的代謝平衡，使軟骨細胞生存內環境惡化，最終導致軟骨細胞變性壞死，軟骨組織損毀。

CD44是一種跨膜糖蛋白，屬于細胞表面黏附分子家族，具有多種功能和結構形態，參與許多生物學活動，包括細胞遷移、腫瘤發生、轉移以及免疫反應的調節等[5]。正常情況下，機體表達一定量的CD44;CD44異常升高，與許多疾病有關，如動脈粥樣硬化、腫瘤擴散以及骨關節疾病等。sCD44廣泛存在于人體的各種體液中，如血液、淋巴液、關節滑液等，其功能目前還不清楚。有研究表明，sCD44最主要的來源是從細胞膜 CD44水解脫落形成的[6]。

研究顯示，KBD患者軟骨組織 CD44表達明顯，血清中 sCD44增加[7]，而正常人 CD44表達為陰性或弱陽性，提示在 KBD發生、發展過程中 CD44的表達及代謝調控發生改變。風濕性關節炎(RA)和骨關節炎(OA)患者軟骨細胞中 CD44mRNA表達升高，其關節軟骨壞死處軟骨細胞 CD44的表達顯著降低，而關節滑液中 sCD44含量則顯著升高，并呈一定的量效關系[8，9]。這些結果提示 KBD時關節軟骨代謝改變機制與 RA、OA存在相似之處，又有著顯著不同。本研究發現，在 NIV毒素作用下，軟骨細胞 CD44mRNA及 CD44蛋白表達急劇增加;而加硒后稍有降低。加入 NIV毒素及硒后 CD44表達有所恢復，但不明顯。NIV組細胞培養液中 sCD44顯著增高，加硒后趨勢不變。由此可見，真菌毒素致實驗性軟骨損傷黏附分子 CD44的代謝紊亂與 KBD及其他骨關節病有相似之處。

由以上結果，我們推測:①NIV毒素作用于軟骨細胞首先通過其毒理作用使得大量細胞表面黏附分子 CD44脫落，進而刺激軟骨細胞產生大量 CD44，因而表現為 CD44mRNA、CD44蛋白以及 sCD44均升高;同時大量細胞表面 CD44分子又促進 HA內在化，導致細胞外 HA減少，進而使得結合其上的蛋白聚糖解聚、丟失，胞外基質代謝失衡，最終導致軟骨細胞變性、壞死。②硒對 NIV毒素所造成的損傷具有一定的保護作用，但對正常軟骨細胞的作用非常有限。當硒對抗毒素的損傷作用時，軟骨細胞表面信息分子 CD44脫落減少，因而 CD44表達比毒素組降低;后者使得胞外 HA與其受體 CD44達到較好的平衡狀態，因而胞外基質代謝相對平衡。提示補硒可以在一定程度上拮抗 NIV毒素對軟骨細胞的毒性作用，但保護作用有限，不能從根本上防止損傷的發生。

綜上所述，NIV毒素和缺硒是影響體外培養軟骨細胞 CD44代謝紊亂的重要因素，但它們是否為KBD的病因，還需進一步研究證實。

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