人 TAT-PDX-1融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

苗 成，宋 波，王 茜，張 寧，韓志強(qiáng)，許予明

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致缺血性腦血管病缺血半暗帶區(qū)損傷的重要原因之一[1]，抑制缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是近年來(lái)急性腦缺血性疾病治療的新途徑。近期研究發(fā)現(xiàn)，胰十二指腸同源盒基因-1(PDX-1)不僅是抑制胰腺 β細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[2，3]，且高表達(dá)于胰腺組織之外的多種人類(lèi)腫瘤組織和細(xì)胞中，可通過(guò)抑制多種組織細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4，5]。TAT多肽是人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)-1編碼的反式激活蛋白(TAT)的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。研究表明，TAT多肽具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，與其他外源蛋白質(zhì)融合后表達(dá)的融合蛋白(TAT-蛋白質(zhì))能夠高效地進(jìn)入人體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)組織中[6，7]，甚至可以穿透血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)細(xì)胞并且表現(xiàn)出生物學(xué)功能。2007～2009年，我們利用大腸桿菌高效表達(dá)有穿透能力的重組 TAT-PDX-1融合蛋白，探討PDX-1抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 材料 流產(chǎn)胎兒胰腺組織從鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科獲得(經(jīng)父母同意)。p ET-28a(Novagen公司 )，大腸桿菌 DH5α、BL21(鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶、Taq DNA聚合酶(MBI公司)，IPTG(Boehringer Manheim公司)，鼠抗 His單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收純化試劑盒(上海華舜生物工程公司)，其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。PCR引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重組原核表達(dá)載體構(gòu)建 質(zhì)粒提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化和 DNA膠回收純化均按文獻(xiàn)[8]和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。剪取胰腺組織，迅速置液氮中，并用玻璃棒將組織塊碾成粉末。按試劑盒操作步驟提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，采用 RT-PCR法在 PDX-1基因兩端引入酶切位點(diǎn)。將回收后的 PCR產(chǎn)物分別用 HindIII和 BamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收。膠回收產(chǎn)物與 pET-28a和 T4 DNA連接酶室溫過(guò)夜連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α、挑取克隆、酶切鑒定得到重組表達(dá)載體 pET28a-TAT-PDX-1。

1.2.2 工程菌 E.coli.BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化和 TATPDX-1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TAT-pdx-1轉(zhuǎn)化感受態(tài) BL21(DE3)大腸桿菌，轉(zhuǎn)化的菌液鋪于含 Ampicillin(100 g/L)的 LB平板上，37℃溫箱培養(yǎng)待長(zhǎng)出菌落。挑單菌落接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，然后用新鮮培養(yǎng)基按 1∶50比例稀釋?zhuān)瑪U(kuò)大培養(yǎng)至 D600≈0.8時(shí)加入終濃度為 0.1 mmol/L的 IPTG，25℃培養(yǎng) 6 h。4℃、5 000 r/min離心 5 min，收集細(xì)菌沉淀，加 50 ml結(jié)合緩沖液(5 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris? HCl，p H7.9)重懸菌體 。然后冰浴超聲破菌(400 W、5 s/15 s、30 min)，將菌液置超速冷凍離心機(jī)中 20 000 r/min離心 10 min，以除去細(xì)胞壁，融合蛋白以可溶的形式存在于上清中。

1.2.3 融合蛋白純化 用結(jié)合緩沖液平衡好的含NovagenTM鎳親和凝膠層析柱，加入離心得到的超聲上清液，上樣完畢后靜置 2 h，用不同濃度咪唑的洗脫緩沖液，進(jìn)行分步洗脫。收集峰值洗脫液行SDS-PAGE和 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)、水平及純化效果。洗脫的蛋白加入 10%甘油后用生物半透膜透析 48 h，以充分脫鹽(透析液為 pH7.4的 PBS，含 10%甘油)。純化的融合蛋白過(guò) 0.22μm濾器除菌后，用 1.5 ml Eppendorf管分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 重組原核表達(dá)載體鑒定 BamHI和 HindIII雙酶切后獲得小片段與 TAT-PDX-1 RT-PCR產(chǎn)物的大小一致。DNA測(cè)序與預(yù)期結(jié)果一致，無(wú) PCR突變，證實(shí)重組原核表達(dá)載體pET-28a-TAT-PDX-1構(gòu)建成功。

2.2 pET28a-TAT-PDX-1在大腸桿菌中的表達(dá)與純化 分別對(duì)上清和沉淀行 SDS-PAGE分析，在 44 kD位置出現(xiàn)目標(biāo)條帶。TAT-PDX-1表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白 20%，有可溶性和包涵體兩種存在形式。37℃蛋白表達(dá)量最高，但包涵體含量也高，降低誘導(dǎo)溫度，在 25℃時(shí)，TAT-PDX-1可溶性蛋白含量為最高。因此本實(shí)驗(yàn)采用 25℃誘導(dǎo) 4 h為誘導(dǎo)條件。免疫結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物與 His單克隆抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)。見(jiàn)圖1。

圖1 TAT-PDX-1融合蛋白的 SDS-PAGE分析和 Western-blot分析

3 討論

PDX-1定位于人類(lèi)染色體組的 13q12.1，包含 1個(gè)內(nèi)含子和 2個(gè)外顯子，特異表達(dá)于胰腺 β細(xì)胞，編碼的蛋白胰十二指腸同源盒因子-1，是一種含有同源盒的轉(zhuǎn)錄因子。以往研究表明，PDX-1在胰腺生長(zhǎng)發(fā)育和胰島素基因轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，對(duì)胚胎時(shí)期的胰腺發(fā)育和維持正常 β細(xì)胞功能起至關(guān)重要的作用[8]。近期發(fā)現(xiàn)，鼠及人的 PDX-1(-/-)純合子一般由于胰腺發(fā)育障礙而早亡，PDX-1缺乏的雜合子中，多在成年時(shí)胰島素基因表達(dá)異常而出現(xiàn)葡萄糖耐量異常。PDX-1(+/-)胰島細(xì)胞對(duì)凋亡因子的敏感性增強(qiáng)，細(xì)胞中抗凋亡蛋白 Bcl-2和Bcl-XL減少，而凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3活性增強(qiáng)，胰島的凋亡數(shù)增多，胰島數(shù)目減少[9]。因此 PDX-1表達(dá)降低會(huì)引起胰腺 β細(xì)胞凋亡從而影響胰島內(nèi)分泌功能，即 PDX-1具有抗胰腺 β細(xì)胞凋亡的作用[10，11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PDX-1高表達(dá)于胰腺組織之外的多種人類(lèi)腫瘤組織中[4，5]。我們采用 RNAi技術(shù)干擾多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞 PDX-1表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，推測(cè) PDX-1的抗凋亡作用不僅在于胰腺 β細(xì)胞，可能是抗凋亡家族的一員。而將 PDX-1作為抗凋亡因子用于急性缺血性腦血管病的神經(jīng)保護(hù)研究，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)類(lèi)似報(bào)道。

研究基因的方法眾多，常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率低(＜20%)，且對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大;病毒載體插入突變和產(chǎn)生非特異細(xì)胞免疫作用等均限制了其臨床應(yīng)用。TAT蛋白是人類(lèi)免疫缺陷病毒 HIV-1的反式激活因子，由 86個(gè)氨基酸組成。TAT多肽是一個(gè) TAT蛋白中富含堿性氨基酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)域(YGRKKRRQRRR)，不僅具有廣譜的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，且轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快、效率高。轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)可以大到 120 kD且不增加其免疫性，能夠高效地進(jìn)入人體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)組織中，甚至可以穿透血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)細(xì)胞，并且表現(xiàn)出生物學(xué)功能[6，7]。PTD的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用依賴(lài)于所轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽或蛋白質(zhì)的濃度、轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間。與基因治療不同的是，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞后具有半衰期，更適合臨床應(yīng)用。本研究我們用加入酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基且含 TAT多肽編碼序列的引物，通過(guò) RT-PCR擴(kuò)增的方法，直接獲得TAT-PDX-1的融合基因，省略了 T-A克隆的步驟。人 PDX-1基因由 849個(gè)堿基組成，編碼 283個(gè)氨基酸，本研究在大腸桿菌中表達(dá) TAT-PDX-1融合蛋白，盡管 SDS-PAGE的遷移率與理論值有所差異，但免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物確系 TAT-PDX-1融合蛋白。Tat-PTD融合蛋白少數(shù)以一種可溶的形式在細(xì)菌中被表達(dá)，但大多數(shù)是以不可溶形式出現(xiàn)在細(xì)菌的包涵體內(nèi)。在表達(dá)過(guò)程中，我們采用低溫、低 IPTG、低轉(zhuǎn)速等方法獲得了可溶性融合蛋白TAT-PDX-1，并利用 HisTag獲得了較為滿(mǎn)意的純化效果。本研究中 PTD序列直接與所表達(dá)的 PDX-1相連，不同于以往研究中在 PTD序列和目標(biāo)蛋白之間還有一段其他的標(biāo)簽分子序列，這樣表達(dá)出的蛋白更接近于天然蛋白，有助于其功能的發(fā)揮，有利于對(duì)更多的功能性蛋白進(jìn)行篩選[12]。

總之，本研究構(gòu)建了重組 TAT-PDX-1的原核表達(dá)載體，并成功表達(dá)和純化了帶有穿透肽的融合蛋白 TAT-PDX-1，為進(jìn)一步研究 PDX-1基因在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ);該載體也可用來(lái)制備抗PDX-1的單克隆抗體。

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