人 TAT-PDX-1融合蛋白在大腸桿菌中的表達與純化

苗 成，宋 波，王 茜，張 寧，韓志強，許予明

(鄭州大學第一附屬醫院，鄭州 450052)

細胞凋亡是導致缺血性腦血管病缺血半暗帶區損傷的重要原因之一[1]，抑制缺血半暗帶區神經細胞凋亡，是近年來急性腦缺血性疾病治療的新途徑。近期研究發現，胰十二指腸同源盒基因-1(PDX-1)不僅是抑制胰腺 β細胞凋亡的關鍵調節因子[2，3]，且高表達于胰腺組織之外的多種人類腫瘤組織和細胞中，可通過抑制多種組織細胞凋亡導致腫瘤的發生[4，5]。TAT多肽是人類免疫缺陷病毒(HIV)-1編碼的反式激活蛋白(TAT)的轉導結構域。研究表明，TAT多肽具有蛋白轉導功能，與其他外源蛋白質融合后表達的融合蛋白(TAT-蛋白質)能夠高效地進入人體外培養的細胞和體內組織中[6，7]，甚至可以穿透血腦屏障進入中樞神經細胞并且表現出生物學功能。2007～2009年，我們利用大腸桿菌高效表達有穿透能力的重組 TAT-PDX-1融合蛋白，探討PDX-1抗神經細胞凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 材料 流產胎兒胰腺組織從鄭州大學醫學院第一附屬醫院婦產科獲得(經父母同意)。p ET-28a(Novagen公司 )，大腸桿菌 DH5α、BL21(鄭州大學醫學院重點實驗室)。T4 DNA連接酶、限制性內切酶、Taq DNA聚合酶(MBI公司)，IPTG(Boehringer Manheim公司)，鼠抗 His單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，質粒提取試劑盒和膠回收純化試劑盒(上海華舜生物工程公司)，其余試劑均為進口或國產分析純級。PCR引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重組原核表達載體構建 質粒提取、酶切、連接、轉化和 DNA膠回收純化均按文獻[8]和試劑盒說明書進行。剪取胰腺組織，迅速置液氮中，并用玻璃棒將組織塊碾成粉末。按試劑盒操作步驟提取總RNA，逆轉錄為 cDNA，采用 RT-PCR法在 PDX-1基因兩端引入酶切位點。將回收后的 PCR產物分別用 HindIII和 BamHI雙酶切，酶切產物用膠回收試劑盒回收。膠回收產物與 pET-28a和 T4 DNA連接酶室溫過夜連接、轉化大腸桿菌 DH5α、挑取克隆、酶切鑒定得到重組表達載體 pET28a-TAT-PDX-1。

1.2.2 工程菌 E.coli.BL21(DE3)的轉化和 TATPDX-1融合蛋白的誘導表達 將重組表達質粒pET-28a-TAT-pdx-1轉化感受態 BL21(DE3)大腸桿菌，轉化的菌液鋪于含 Ampicillin(100 g/L)的 LB平板上，37℃溫箱培養待長出菌落。挑單菌落接種于5 ml LB液體培養基中，37℃振搖培養過夜，然后用新鮮培養基按 1∶50比例稀釋，擴大培養至 D600≈0.8時加入終濃度為 0.1 mmol/L的 IPTG，25℃培養 6 h。4℃、5 000 r/min離心 5 min，收集細菌沉淀，加 50 ml結合緩沖液(5 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris? HCl，p H7.9)重懸菌體 。然后冰浴超聲破菌(400 W、5 s/15 s、30 min)，將菌液置超速冷凍離心機中 20 000 r/min離心 10 min，以除去細胞壁，融合蛋白以可溶的形式存在于上清中。

1.2.3 融合蛋白純化 用結合緩沖液平衡好的含NovagenTM鎳親和凝膠層析柱，加入離心得到的超聲上清液，上樣完畢后靜置 2 h，用不同濃度咪唑的洗脫緩沖液，進行分步洗脫。收集峰值洗脫液行SDS-PAGE和 Western blot檢測蛋白表達、水平及純化效果。洗脫的蛋白加入 10%甘油后用生物半透膜透析 48 h，以充分脫鹽(透析液為 pH7.4的 PBS，含 10%甘油)。純化的融合蛋白過 0.22μm濾器除菌后，用 1.5 ml Eppendorf管分裝，-20℃保存備用。

2 結果

2.1 重組原核表達載體鑒定 BamHI和 HindIII雙酶切后獲得小片段與 TAT-PDX-1 RT-PCR產物的大小一致。DNA測序與預期結果一致，無 PCR突變，證實重組原核表達載體pET-28a-TAT-PDX-1構建成功。

2.2 pET28a-TAT-PDX-1在大腸桿菌中的表達與純化 分別對上清和沉淀行 SDS-PAGE分析，在 44 kD位置出現目標條帶。TAT-PDX-1表達量占細菌總蛋白 20%，有可溶性和包涵體兩種存在形式。37℃蛋白表達量最高，但包涵體含量也高，降低誘導溫度，在 25℃時，TAT-PDX-1可溶性蛋白含量為最高。因此本實驗采用 25℃誘導 4 h為誘導條件。免疫結果顯示誘導后的表達產物與 His單克隆抗體呈陽性反應。見圖1。

圖1 TAT-PDX-1融合蛋白的 SDS-PAGE分析和 Western-blot分析

3 討論

PDX-1定位于人類染色體組的 13q12.1，包含 1個內含子和 2個外顯子，特異表達于胰腺 β細胞，編碼的蛋白胰十二指腸同源盒因子-1，是一種含有同源盒的轉錄因子。以往研究表明，PDX-1在胰腺生長發育和胰島素基因轉錄中起關鍵作用，對胚胎時期的胰腺發育和維持正常 β細胞功能起至關重要的作用[8]。近期發現，鼠及人的 PDX-1(-/-)純合子一般由于胰腺發育障礙而早亡，PDX-1缺乏的雜合子中，多在成年時胰島素基因表達異常而出現葡萄糖耐量異常。PDX-1(+/-)胰島細胞對凋亡因子的敏感性增強，細胞中抗凋亡蛋白 Bcl-2和Bcl-XL減少，而凋亡相關蛋白 Caspase-3活性增強，胰島的凋亡數增多，胰島數目減少[9]。因此 PDX-1表達降低會引起胰腺 β細胞凋亡從而影響胰島內分泌功能，即 PDX-1具有抗胰腺 β細胞凋亡的作用[10，11]。最近研究發現，PDX-1高表達于胰腺組織之外的多種人類腫瘤組織中[4，5]。我們采用 RNAi技術干擾多種人類腫瘤細胞 PDX-1表達后，腫瘤細胞出現不同程度的凋亡，推測 PDX-1的抗凋亡作用不僅在于胰腺 β細胞，可能是抗凋亡家族的一員。而將 PDX-1作為抗凋亡因子用于急性缺血性腦血管病的神經保護研究，目前國內外尚無類似報道。

研究基因的方法眾多，常用的脂質體轉染效率低(＜20%)，且對細胞的毒性作用較大;病毒載體插入突變和產生非特異細胞免疫作用等均限制了其臨床應用。TAT蛋白是人類免疫缺陷病毒 HIV-1的反式激活因子，由 86個氨基酸組成。TAT多肽是一個 TAT蛋白中富含堿性氨基酸殘基的蛋白結構域(YGRKKRRQRRR)，不僅具有廣譜的蛋白轉導作用，且轉導速度快、效率高。轉導的蛋白質可以大到 120 kD且不增加其免疫性，能夠高效地進入人體外培養的細胞和體內組織中，甚至可以穿透血腦屏障進入中樞神經細胞，并且表現出生物學功能[6，7]。PTD的轉導作用依賴于所轉導多肽或蛋白質的濃度、轉導時間。與基因治療不同的是，蛋白轉導入細胞后具有半衰期，更適合臨床應用。本研究我們用加入酶切位點及其保護堿基且含 TAT多肽編碼序列的引物，通過 RT-PCR擴增的方法，直接獲得TAT-PDX-1的融合基因，省略了 T-A克隆的步驟。人 PDX-1基因由 849個堿基組成，編碼 283個氨基酸，本研究在大腸桿菌中表達 TAT-PDX-1融合蛋白，盡管 SDS-PAGE的遷移率與理論值有所差異，但免疫印跡試驗結果顯示表達產物確系 TAT-PDX-1融合蛋白。Tat-PTD融合蛋白少數以一種可溶的形式在細菌中被表達，但大多數是以不可溶形式出現在細菌的包涵體內。在表達過程中，我們采用低溫、低 IPTG、低轉速等方法獲得了可溶性融合蛋白TAT-PDX-1，并利用 HisTag獲得了較為滿意的純化效果。本研究中 PTD序列直接與所表達的 PDX-1相連，不同于以往研究中在 PTD序列和目標蛋白之間還有一段其他的標簽分子序列，這樣表達出的蛋白更接近于天然蛋白，有助于其功能的發揮，有利于對更多的功能性蛋白進行篩選[12]。

總之，本研究構建了重組 TAT-PDX-1的原核表達載體，并成功表達和純化了帶有穿透肽的融合蛋白 TAT-PDX-1，為進一步研究 PDX-1基因在神經系統領域的應用奠定了基礎;該載體也可用來制備抗PDX-1的單克隆抗體。

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