誘導型一氧化氮合酶在創傷性腦損傷后腸黏膜屏障損傷中表達的變化

呂 棟，崔培林，徐有青，楊昭徐

(首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京100050)

創傷性腦損傷(TBI)作為一種嚴重的應激源，也可以引起腸黏膜屏障損傷［1，2］，但其發病機制的研究目前還較少。研究發現，在腸黏膜炎癥過程中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達和活性及其產物一氧化氮(NO)的含量明顯增加，并與炎癥程度有關［3］。本研究通過觀察TBI后腸黏膜屏障損傷時iNOS表達的變化探討其在腸黏膜屏障損傷時可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12周齡健康雄性Wistar大鼠48只，體質量200～250 g，由中國科學院遺傳與發育生物學研究所動物中心提供。實驗前于北京市神經外科研究所動物室，在恒溫、恒濕、12 h光照/黑暗交替條件下，給予嚙齒類動物標準飲食進行飼養。

1.2 試劑與儀器 二胺氧化酶(DAO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，鱟試劑盒及內毒素標準品購自上海伊華臨床醫學科技公司，組織裂解液購自碧云天公司，30%丙烯酰胺貯液、四甲基乙二胺、10%的十二烷基硫酸鈉購自北京化學試劑公司、Western Blotting Luminol Reagent化學發光試劑盒、兔iNOS單克隆抗體、PVDF膜購自Sant Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。307－2B牙科臺式電鉆、鼠立體定位儀、自由落體致顱腦損傷裝置、低溫組織勻漿機、高速臺式冷凍離心機、ECL化學發光成像系統、熒光分光光度儀由北京市神經外科研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 TBI模型的制備及分組 采用自由落體撞擊法建立TBI模型［4］。48只大鼠，隨機數字法平均分為2組，A組為假手術組(對照組);B組為TBI組。對照組動物只開骨窗不行自由落體撞擊。2組動物分別在手術后3、6、12、24 h點處死，取腦組織和距回盲部5 cm處回腸5 cm，進行相關指標檢測。

1.3.2 細胞形態學觀察 動物處死后，取腦組織和末端回腸組織用10%甲醛固定后進行普通光鏡檢查。

1.3.3 腸黏膜通透性測定 動物處死后，門靜脈取血測血清中內毒素濃度及DAO的活性，同時取末端回腸組織，低溫下快速制成組織勻漿，3 000 r/min，離心10 min后取上清液備用，按試劑盒說明書嚴格操作，測定腸黏膜組織中DAO活性。

1.3.4 iNOS蛋白檢測 取凍存的新鮮腸黏膜組織200 mg，在液氮預冷的研缽中研碎，加入組織裂解液，冰上放置20 min，13 000 r/min低溫下離心15 min，取上請，用Bradford法進行蛋白定量分裝，放入－80℃冰箱保存。免疫蛋白印跡法測定總蛋白中iNOS含量。

1.3.5 統計學方法 采用SPSS13.0軟件對數據進行統計學處理，數據用表示，同組不同時間計量資料采用方差分析，組間計量資料比較采用t檢驗。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 組織學改變

2.1.1 腦組織形態學改變 TBI組蛛網膜下腔增寬并有灶性出血，腦組織結構疏松，神經元固縮、變性、部分缺失，膠原細胞增生，纖維母細胞增生、機化，小血管增生，管壁機化，少量淋巴細胞浸潤。對照組腦組織僅見少量炎性細胞浸潤，余基本正常。

2.1.2 腸黏膜組織細胞形態學改變 光鏡下，TBI組3 h黏膜出現損傷，絨毛水腫，局部有缺損;6 h腸絨毛腫脹、縮短、增粗，頂端部分破損或斷裂，破損處有淋巴細胞浸潤;12 h黏膜明顯損傷，出現局灶性糜爛、壞死，絨毛斷裂或相互融合，淋巴管擴張，有炎性細胞浸潤;24 h損傷進一步加重，上皮細胞變性、壞死，黏膜有壞死脫落區域。

2.2 檢測指標變化

2.2.1 內毒素和DAO的變化 TBI組3 h時血中內毒素已經升高，隨時間增加升高幅度逐漸增大，在觀察期限內24 h最為明顯(P＜0.01)。腸黏膜組織DAO，TBI組3 h活性已經開始下降，隨時間增加下降程度逐漸加重，在24 h最為明顯(P＜0.01);而血清中DAO活性的變化剛好相反，見表1。

表1 各組大鼠門靜脈血內毒素水平及DAO含量變化(EU/ml±s)

表1 各組大鼠門靜脈血內毒素水平及DAO含量變化(EU/ml±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05，△P ＜0.01

組別 內毒素(E U/m l)腸黏膜組織D A O(U/m g)血清D A O(U/m g)對照組3 h 0.1 0 5±0.0 0 6 0.9 2±0.0 8 1.2 1±0.2 8 6 h 0.1 0 3±0.0 1 6 0.9 4±0.1 2 1.2 6±0.4 3 1 2 h 0.1 1 2±0.0 1 6 0.9 0±0.1 1 1.2 5±0.3 1 2 4 h 0.1 1 4±0.0 2 1 0.9 6±0.0 9 1.1 8±0.2 5 T B I組3 h 0.2 8 9±0.0 1 7* 0.6 3±0.1 3* 3.0 3±0.3 3*6 h 0.3 7 8±0.0 2 1△ 0.4 7±0.0 7△ 3.5 6±0.5 9△1 2 h 0.4 7 7±0.0 2 6△ 0.3 9±0.0 8△ 3.7 9±0.4 5△2 4 h 0.4 7 9±0.0 1 9△ 0.3 1±0.0 7△ 4.5 1±0.5 7△

2.2.2 腸黏膜組織中iNOS蛋白變化 與對照組比較，TBI組3 h iNOS蛋白表達已經開始增加(P＜0.05)，然后隨時間延長表達逐漸增加，12 h為最高(P＜0.01)，而后逐漸降低，見圖1。

圖1 腸黏膜組織中iNOS蛋白表達的電泳結果

3 討論

本實驗采用自由落體撞擊法成功建立了TBI的動物模型，形態學證實腸黏膜結構受到損傷。DAO和內毒素是反映小腸黏膜屏障結構和功能的理想指標，本實驗中，小腸黏膜組織中DAO活性明顯降低，而血清中的DAO活性則明顯升高，提示腸黏膜屏障受損，DAO被大量釋放入血。同樣TBI組各時間點血中內毒素水平也明顯升高，提示內毒素、細菌和大分子物質穿越受損的腸黏膜而發生移位。DAO、內毒素的變化均反映了腸黏膜的通透性增加，腸黏膜屏障功能受到了損傷。

NO是由左旋精氨酸和分子氧在NOS的催化下生成的。一定量的內源性NO是維持腸黏膜正常結構所必需的［5］。它可以擴張腸道微血管，調節腸道血流，減輕缺血/再灌注損傷，維持腸黏膜完整性，有效地阻止腸道菌群移位。大量的NO能直接損傷細胞的DNA;可以作用于線粒體，阻斷電子傳遞鏈，抑制細胞內呼吸，致細胞缺氧和細胞內自由基增加［6］;可以刺激單核巨噬細胞系統釋放細胞因子即內毒素，誘導細胞凋亡或對靶細胞產生直接損傷作用，因此有明顯的細胞毒作用［7］。iNOS主要存在于巨噬細胞、肝細胞、軟骨細胞，它們的表達是鈣非依賴型的。只有當機體內出現致炎因子或內毒素時，或是機體處于低氧甚至休克狀態時iNOS才大量表達，合成大量的NO［8］，它的表達需要多種物質的誘導。在哺乳動物的胃腸道組織中存在NOS的廣泛表達，它們主要分布在胃腸的黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層以及壁內神經叢，黏膜下層小動脈細胞及平滑肌細胞中也有NOS分布。這一特點提示在各種原因導致的腸黏膜損傷的機制中，有可能也涉及到iNOS高表達引起的NO大量產生［9］。本實驗采用免疫印跡方法方法檢測了腸黏膜組織中iNOS的表達情況，結果發現，在TBI后3 h，腸黏膜組織中的iNOS的蛋白表達開始增加，隨后逐漸升高，12 h達到高峰后逐漸降低。這一結果與腸黏膜屏障損傷程度的變化相一致，說明了TBI后腸黏膜組織中的iNOS被誘導激活，表達增加，從而產生大量NO，參與了TBI后腸黏膜屏障的損傷。

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［4］王燕斌，楊昭徐.重度創傷性腦損傷后腸黏膜屏障的應激性變化的模型［J］.中國實驗動物學報，2007，15(3):220－222.

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［9］梅俏，許建明，項立，等.一氧化氮在結腸黏膜上皮細胞氧化損傷中的作用觀察［J］.安徽醫科大學學報，2006，41(1):38－40.