膀胱移行細胞癌 E2F3、miR－17－5p、miR－20a 的表達及相關性分析

任海林，孫 巖，李世斌，韓瑞發

(天津醫科大學第二醫院天津市泌尿外科研究所，天津300211)

miR－17－5p 和 miR－20a 是 mir－17－92 基因簇產物，通過轉錄后基因沉默效應調控多種抑癌基因或癌基因的表達，在不同的腫瘤中起抑癌基因或癌基因的作用。E2F3屬于轉錄因子E2F家族，在膀胱癌中有擴增和過表達［1］，E2F3有很強的促進 mir－17－92 基因簇啟動子活性作用，并誘導 mir－17－92 基因簇表達［2，3］。我們期望通過研究 E2F3、miR－17－5p和miR－20a在膀胱癌組織中的表達情況，闡明E2F3、miR－17－5p 和 miR－20a 之間是否存在相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱組織標本選用我院2009年10月～2010年2月行膀胱全切或部分切除術的20例膀胱組織，并經術后病理證實為膀胱移行細胞癌，新鮮組織獲得后立即放置于－80℃超低溫冰箱。患者術前均未行放療、化療與免疫治療。其中男16例、女4例，年齡43～81歲、平均58.15歲。組織病理分級按照WHO(1973年)分級標準，其中G1級10例，G2級4例，G3級6例。另取10例開放前列腺摘除術患者的正常膀胱黏膜組織作為對照。膀胱移行細胞癌細胞系5637、T24購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，在含10%小牛血清RPMI－1640培養基，37℃、5%CO2條件下培養。總RNA提取試劑盒購自申能博彩生物科技有限公司;cDNAD第一鏈合成試劑盒購自 QIAGEN 公司;E2F3、miR－17－5p、miR－20a熒光探針和內參GAPDH、U6熒光探針，2×PCR TaqMan?Universal PCR，TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription ki均購自 ABI公司;鼠抗人E2F3和GAPDH抗體購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 基因的表達檢測 取凍存組織和膀胱移行細胞癌細胞系5637、T24，放于DEPC處理的1.5 ml EP管中。加組織裂解液后，應用超聲細胞粉碎機粉碎組織，按試劑盒說明提取總RNA。按cDNAD第一鏈合成試劑盒說明用提取的總RNA逆轉錄合成第一鏈cDNAD，按2×PCR TaqMan?Universal PCR說明，以第一鏈cDNAD為模板、E2F3和GAPDH熒光探針為引物擴增，反應條件:95℃變性10 min，95℃復性15 s，60 ℃延長 1 min，共40 個循環;按 TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit操作手冊說明，以提取的總 RNA 為模板，用 miR－17－5p、miR－20a 和 U6 逆轉錄引物(5×TaqMan?Gene Expression Assay Mix)逆轉錄合成 miR－17－5p、miR－20a 和 U6 第一鏈，反應條件:16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃延長5 min;然后按2×PCR TaqMan?Universal PCR試劑盒說明，以miR－17－5p、miR－20a 和 U6 第一鏈為模板，用 miR－17－5p、miR－20a和U6熒光探針(10 ×TaqMan?Gene Expression Assay Mix)為引物擴增;以上熒光PCR檢測均在7900HT型熒光定量PCR儀(ABI公司)操作完成，檢測方法為相對定量分析2－ΔΔCt法，每個樣品每次試驗至少設立3個重復，重復3次試驗。

1.2.2 檢測E2F3蛋白變化 取不同病理分級組織、正常黏膜對照組織適量，加組織裂解液后超聲細胞粉碎機粉碎組織，13 000 g離心3～5 min，取上清液。用SDS－PAGE電泳(5%層積膠，12%分離膠)，電轉移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉過夜，一抗于4℃孵育4 h，TBS洗滌3次×5 min;辣根過氧化物酶標記的二抗于室溫孵育2 h，TBS洗滌3次×5 min，膜與化學發光底物孵育5～10 min，經X線片曝光、顯影、定影。用凝膠成像分析軟件BandScan 5.0進行灰度分析。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS11.5軟件對數據進行統計處理，所得數據均以±s表示，3組樣本以上計量資料用方差分析，多樣本均數間的多重比較用Dunnett－t檢驗。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

各組 E2F3、miR－17－5p 及 miR－20a 表達水平比較見表1。

表1 E2F3、miR-17-5p 及 miR-20 相對定量(2－ΔΔCt)分析結果(ˉx ±s)

3 討論

E2F3參與調控細胞周期與DNA復制，可以促進循環細胞的 G1/S 期轉換［4］。Feber等［1］檢測了TCCSUP、5637和HT1376 3種膀胱癌細胞系，發現在這3種細胞系中E2F3的mRNA過表達，均有高水平的E2F3蛋白質生成。本試驗也發現膀胱癌組織E2F3的mRNA和蛋白相對正常膀胱組織都呈高表達狀態，E2F3蛋白有隨著病理分級的升高而升高的趨勢。綜上所述，可以推斷E2F3是一種能促發膀胱癌的癌基因。

本研究發現，在膀胱癌細胞系中，高分化的5637較低分化的T24高表達E2F3蛋白，這與癌組織是正好相反的，這與Feber等［1］的研究是一致的，這一現象說明不同來源的組織和細胞其基因的表達和調控是不同的，也充分說明了基因調控的復雜性。miRNA在基因組上的分布是成簇的，同一基因簇內的miRNA作為一個整體，通過一個共同的啟動子被轉錄，然后經過一系列轉錄后加工形成不同的單體miRNA［5］。mir－17－92 是 miRNA 家族中一組多順反子簇，包含了 7 個成熟的 miRNA:miR－17－5p、miR－17－3p、miR－18、miR－19a、miR－20a、miR－19b－1 和 miR－92－1［6］。已有研究認為，E2F3 有很強的誘導 mir－17－92基因簇表達、并促進 mir－17－92基因簇啟動子活性作用［3］，研究同時也證實，mir－17－92 基因簇產物miR－17－5p 和 miRNA－20a 可以調節 E2F3 的蛋白表達［7］。這樣 mir－17－92、E2F3 就形成了一個調控網絡。以 mir－17－92 和 E2F1、E2F2、E2F3 為核心的反饋調控環路已在淋巴瘤、前列腺癌、宮頸癌［8］等腫瘤中證實。本研究發現 miR－17－5p和 miR－20a相對正常膀胱組織都呈高表達狀態，miR－20a有隨著病理分級的升高而降低的的趨勢，miR－17－5p、miR－20a的表達與E2F3的增高有某種程度的相關性。E2F3是促發膀胱癌的癌基因，miRNA是一類負調控其他蛋白質編碼基因的基因，在不同的腫瘤中起抑癌基因或是癌基因的作用，由此推斷:癌基因E2F3高表達誘導并促進 mir－17－92基因簇轉錄，其產物 miR－17－5p、miR－20a抑制 E2F3蛋白表達的進一步升高，使E2F3的表達維持在適當的范圍，miR－17－5p 和miR－20a在膀胱癌中可能是一種腫瘤抑制因子。

綜上所述，E2F3、miR－17－5p、miR－20a 是否在膀胱癌中構成調控環路，尚需進一步研究證實。對E2F3與mir－17－92基因簇之間的調控環路的研究可能為膀胱癌發病機制研究和膀胱癌生物治療帶來重大突破，同時可為膀胱腫瘤提供一個全新的腫瘤標記物，對膀胱癌的診斷和預測將有重要臨床價值。

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