利多卡因對高氧暴露早產大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞SPA、SPB、SPcmRNA表達的影響

(湖南省人民醫院，長沙410005)

早產兒對缺氧耐受性差，使用氧療的機會多，然而，氧毒性對早產兒可產生嚴重后遺癥，如肺損傷和視網膜病等。肺表面活性物質蛋白(SP)合成和分泌的多少是反映肺泡Ⅱ型上皮細胞(AECⅡ)功能的一項重要指標。SP缺乏或功能不足易發生肺損傷。有報道稱吸入高濃度氧可引起SP不足或活性降低，與早產兒高氧肺損傷的發生密切相關［1］，給予外源性SP可以預防慢性肺損傷(CLD)的發生。利多卡因(Lido)可作用于中性粒細胞參與炎癥反應的各個環節，減輕多種原因引起的急性肺損傷(ALI)［2］，但其對早產兒高氧所致的肺損傷是否亦具有保護作用目前尚少見報道。2007年12月～2008年11月進行本研究，擬觀察Lido對高氧環境下早產大鼠AECⅡ功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，體質量200～250 g，購自湖南農業大學實驗動物部。

1.2 主要試劑 小鼠抗Cytokeratin單克隆抗體及熒光顯色劑(武漢博士德生物公司);95%O2-5%CO2高純混合氣購自湖南蓮湖氧氣廠;Lido(常州康普藥業有限公司，0710065);TRIzol總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(長沙贏潤生物工程公司);SYBGREEN PCR Master Mix(美國ABI公司)。

1.3 主要儀器 Elx-800酶聯免疫檢測儀，美國Bio-Tek公司產品;CYS1數字式測氧儀，上海嘉定學聯儀表廠;7500型定量PCR儀，美國ABI公司;電子分析天平，美國Sartorius公司。

1.4 早產鼠AECⅡ原代培養 SD大鼠雌雄按3∶1同籠過夜，次日晨檢查雌鼠陰道陰栓計為孕0 d，孕期滿20 d(足月為22 d)時行剖宮產術，取出胎鼠作為早產鼠。剪開胎鼠胸腔，取出肺組織，參照并改進文獻［3］方法分離純化AECⅡ，將細胞以5×105/L接種于50ml培養瓶中，培養48 h后用免疫組化及電鏡鑒定，結果為細胞數量多、純度高符合本實驗要求。

1.5 實驗分組 早產鼠AECⅡ經貼壁純化后隨機分為4組(每組5瓶):空氣(Air)組、高氧(HO)組、Air+Lido組、HO+Lido組。HO、HO+Lido組在更換培養液后按5 L/min通入95%O2-5%CO2高純混合氣，10min后密封。Air+Lido、HO+Lido組在更換培養液時加入20 μg/ml(根據MTT實驗結果)Lido，各組均置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，收取各組細胞進行實時熒光定量PCR檢測。其中HO、HO+Lido組在培養結束時用CYS1數字式測氧儀測培養瓶中氧濃度，棄去低于90%的標本。

1.6 MTT法 純化的早產鼠AECⅡ以1×106/ml接種于96孔板，置于5%CO2培養箱中培養至融合成單層(約24 h)棄去原培養液，D-hanks液洗去未貼壁細胞，分組處理，每組12孔。對照組:用含15%胎牛血清(FCS)的DMEM培養，不加Lido。Lido組:參照文獻［4］用含2、20、200 μg/ml Lido 的15%FCS的DMEM培養。培養24 h后，每孔加20 μl MTT，培養箱中37℃孵育4 h，棄去培養液，每孔加150 μl DMSO，室溫震蕩10min，酶標免疫測定儀上于490 nm波長處讀吸光度A值，計算各組均數及相對生長指數(GI)。GI=(處理組A490/對照組A490值)×100%。GI＞100%為刺激生長，＜100%為抑制生長。重復實驗3次。

1.7 實時熒光定量PCR 擴增條件為50℃2min、95℃10min、95 ℃15 s、60 ℃1min，40個循環。PCR循環結束后反應溫度從65℃緩慢上升至95℃進行溶解實驗，并繪制溶解曲線，以檢驗擴增特異性。以β-actin為內參照。SPA、B、C的引物序列及擴增片段分別為:SPA-F:5'-TCTTCTTGACTGTTGTCGCTGG-3'，-R:5'-AGGGTCTCCTTTGACACCGT C-3'，135 bp;SPB-F:5'-AGCCTGGAGCAAGCGATACA-3'，-R:5'-GAAAGCGTCTTCCTTGGTCATC-3'，141 bp;SPC-F:5'-GTCCTTGTCGTCGTGGTGATT-3'，-R:5'-GCGATGGTGTCTGTGTGTTCA-3'，149 bp。

1.8 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析后q檢驗，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 形態學結果 每5～7只20 d胎齡早產大鼠經分離純化貼壁后可獲AECⅡ(68±7)×106個，倒置顯微鏡下觀察AECⅡ呈圓形或立方形，典型島狀生長，純度高達87%±3%，苔盼藍實驗檢測細胞活力為95%±1.3%，經免疫組化及電鏡證實確為AECⅡ。充氧前倒置顯微鏡下可見細胞貼壁緊，細胞亮，呈生長狀態。培養24 h后HO、HO+Lido組鏡下觀察見細胞貼壁欠佳，少數細胞內可見顆粒，表現為生長不良狀態;Air、Air+Lido組細胞無明顯改變。

2.2 MTT結果 對照組、Lido 2 μg/ml組、Lido 20 μg/ml組、Lido 200 μg/ml組細胞相對生長指數分別為100%、118.12%、132.88%、116.78%，Lido各濃度組與對照組比較P均＜0.01，20 μg/ml Lido組細胞相對生長指數最高(P＜0.01)。

2.3 實時熒光定量PCR結果 見表1。

3 討論

隨著早產兒機械通氣等侵入性操作的增多，Lido、氯胺酮、咪達唑倫等局部及靜脈麻醉藥物在早產兒中運用也日益增多。Lido作為局部麻醉藥物，安全度高、價格低廉，可減輕多種原因引起的ALI［2］。在高氧所致的ALI中，中性粒細胞通過釋放氧自由基、中性水解酶和溶酶體酶發揮主要作用。Lido減輕ALI的機制與其減少細胞因子釋放及補體系統激活有關。研究表明，吸入高濃度氧可引起SP不足或活性降低，與早產兒高氧肺損傷的發生相關［5］。因此我們選擇高氧作為損傷因子復制細胞損傷模型，旨在進一步探討CLD防治的新方法。

表1 各組細胞SPA、SPB、SPcmRNA表達比較(±s)

表1 各組細胞SPA、SPB、SPcmRNA表達比較(±s)

注:與Air組比較，*P＜0.01;與HO組比較，△P＜0.01

SPA mRNA SPB mRNA SPcmRNA Air組組別 n 5 1 1 1 Air+Lido組 5 1.216±0.058* 1.331±0.064*1.202±0.056*HO組 50.427±0.032*0.309±0.048*0.370±0.035*HO+Lido組 50.659±0.054△0.555±0.044△0.499±0.047△

Lido在一定范圍內可對體外培養的成年鼠AECⅡ引起的肺損傷有一定的保護作用［4，6］。但有關Lido對早產鼠AECⅡ高氧肺損傷的修復作用目前尚少有研究。本研究發現，Lido在20 μg/ml濃度時其細胞相對生長曲線最高，與徐道妙等［4］報道一致，因此選用本濃度做為實驗濃度。結果表明高氧可使早產大鼠AECⅡ合成、分泌SPA、SPB、SPC減少，可能參與高氧肺損傷的發病過程，與祝華平等［7］報道一致。其機制可能是:SPs mRNA表達下調使SPs合成、分泌減少，AECⅡ抗氧化能力下降，對氧誘導肺損傷的易感性增加;AECⅡ增殖受抑制、細胞受到損傷，這些因素直接或間接引起內源性SP減少，從而進一步加重肺損傷。但亦有研究［8］發現，早產鼠高氧暴露早期其SPA、SPB mRNA表達增加，SPcmRNA表達無變化，推測可能與高氧暴露時早產鼠自我保護的方式有關。此與我們觀察的結果不同，可能是由于動物體內肺組織SPs mRNA表達與體外培養AECⅡ的SPs mRNA表達調控方式不同有關。在高氧暴露早產大鼠AECⅡ的培養液中加入Lido后，SPA、SPB、SPcmRNA 表達上調，但未能達到Air組水平，說明Lido可以部分逆轉高氧對肺AECⅡ合成、分泌SP功能的影響，可能與促進AECⅡ增殖有關，但具體機制需進一步探討。

［1］Zenri H，Rodriquez-Capote K，McCaig L，et al.Hyperoxia exposure impairs surfactant function and metabolism ［J］.Crit Care Med，2004，32(5):1155-1160.

［2］DePietro MR，Eichacker PQ.Lidocaine for acute lung injury:questions still to answer［J］.Crit Care Med，2000，28(2):589-591.

［3］祝華平，常立文，李文斌，等.胎鼠肺細胞的分離純化及原代培養［J］.華中科技大學學報(醫學版)，2003，32(6):597-600.

［4］徐道妙，明廣峰，吳曉英，等.利多卡因對LPS致大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞損的保護作用［J］.中南大學學報(醫學版)，2006，31(2):241-244.

［5］Zenri H，Rodriquez-Capote K，McCaig L，et al.Hyperoxia exposure impairs surfactant function and metabolism ［J］.Crit Care Med，2004，32(5):1155-1160.

［6］Nishina K，Mikawa K，Morikawa O，et al.The effects of intravenous anesthetics and lidocaine on proliferation of cultured typeⅡpneumocytes and lung fibroblasts［J］.Anesth Analg，2002，94(2):385-388.

［7］祝華平，常立文，李文斌，等.苦杏仁甙對高氧暴露早產鼠肺泡Ⅱ型細胞表面活性物質蛋白A、B、cmRNA表達的影響［J］.中華圍產醫學雜志，2004，7(4):238-241.

［8］許峰，霍泰輝，翁頌銘，等.早產鼠高氧肺損傷中肺表面活性物質的代謝變化［J］.中國危重病急救醫學，2001，13(12):745-747.