重組人紅細胞生成素對SK-N-SH細胞的保護作用及機制

(中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽110001)

凋亡是腦缺血再灌注后神經元死亡的重要方式［1］，近年有研究表明重組人紅細胞生成素(rhEPO)對神經元的凋亡有保護作用，但其確切機制目前尚不完全清楚［2，3］。隨著對細胞凋亡相關基因改變及其凋亡信號傳導路徑的進一步研究發現，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途徑在細胞凋亡的過程中發揮了極為重要的作用［4］。我們通過建立細胞模型，探討rhEPO對缺氧/復氧后SK-N-SH保護作用及P38MAPK信號通路的作用機制。

1 材料與方法

1.1 神經細胞的培養 SK-N-SH神經母細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。SK-N-SH維持在MEM培養基中，并加進10%小牛血清，0.1 mmol/L非必須氨基酸，5 mmol/L L-谷氨酰氨和抗生素。

1.2 分組及處理 以SK-N-SH細胞培養皿或孔板為觀察單位，隨機分為4組:對照組;Cocl2組:加入300 μmol/L的Cocl2處理4 h，然后更換正常的培養基培養24 h，之后更換無血清的培養基培養;rhEPO組:培養孔中加入50 μmol/ml rhEPO預處理1 h后加入300 μmol/L的Cocl2處理4 h，然后更換正常的培養基培養24 h，之后更換無血清的培養基培養。SB203580組:培養孔中加入rhEPO 1 h后加入300 μmol/L的 Cocl2同時加入 SB203580(10 μmol/L)處理4 h，然后更換正常的培養基培養24 h后更換無血清的培養基培養，再測定有關指標。

1.3 神經元活力測定 MTT自動比色法測神經元活力，每組36 孔，每孔加 MTT 溶液(5 g/L)20 μl，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩15min，選擇490 nm波長測OD值以判斷細胞活力

1.4 RT-PCR檢測 分別在rhEPO預處理后24 h收集細胞提取 bcl-2、P38MAPK、caspase-8 RNA。采用TRIzol試劑盒，RNA的逆轉錄采用Promega公司的逆轉錄試劑盒，采用隨機寡聚六磷酸核苷酸引物合成cDNA。以GAPDH為內對照。擴增產物用0.5×TEB制備，2%瓊脂糖凝膠，以溴酚藍及二甲苯藍為示蹤劑，恒壓電泳，完畢后紫外燈下觀察產物、拍照，用KodakID型凝膠成像分析系統分析其擴增產物，光密度掃描，用內參照對待測產物基因電泳條帶吸光度值進行標準校正，半定量計算bcl-2、caspase-8、P38MAPK mRNA 含量。

1.5 統計學方法 采用 SPSS11.5統計軟件包進行數據統計分析，結果用±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 SK-N-SH細胞增殖 對照組、Cocl2組、rhEPO組與SB203580組神經元活力(OD值)分別為0.679、0.272、0.603、0.265。rhEPO 預處理后，在無血清培養條件下，SK-N-SH細胞的增殖增高(P＜0.05)，而SB203580可以抑制預處理的作用(P＜0.01)。

2.2 RT-PCR檢測結果 rhEPO預處理上調bcl-2和P38MAPK基因的表達(P＜0.01)，下調caspase-8 mRNA的表達(P＜0.01)，SB203580能抑制這種調節作用(P＜0.01)。見表1。

表1 各組bcl-2、caspase-8及P38 MAPK mRNA表達(±s)

表1 各組bcl-2、caspase-8及P38 MAPK mRNA表達(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與Cocl2組比較，△P＜0.01

MAPK對照組組別 bcl-2 caspase-8P38 1.25±0.120.24±0.030.53±0.04 Cocl2組0.31±0.15*0.61±0.04*0.29±0.03*rhEPO組0.98±0.13△0.33±0.03△0.46±0.03△SB203580組0.26±0.320.56±0.070.31±0.34

3 討論

目前研究腦缺血再灌注損傷多采用動物模型，本研究從細胞水平進行腦保護的研究，用Cocl2模擬乏氧刺激，建立了一種簡便細胞乏氧模型。Cocl2是現在比較公認的化學乏氧的模擬物［5］，可以誘導低氧過程的關鍵因子低氧誘導因子1α的上調，從而調節低氧的諸多效應基因的表達變化。

試驗中，我們給予rhEPO預處理后發現，與凋亡有關的基因如bcl-2和caspase-8的表達發生了變化，抑制凋亡基因bcl-2表達增加，而促凋亡基因caspase-8表達減少，這可能是rhEPO對缺氧/復氧損傷的神經細胞的一種保護作用，但具體機制尚不明確。MAPKs是一組絲氨酸/蘇氨酸磷酸化激活的蛋白激酶，是細胞應激和損傷反應的主要信號通路蛋白，可將細胞外刺激信號傳遞至細胞核。P38MAPK是MAPKs亞家族成員之一，P38MAPK途徑在紫外線、滲透壓變化、細胞因子和生理應激反應如炎癥、細胞凋亡中發揮重要作用。已有研究表明，P38MAPK參與了低氧預處理的腦保護，但也有人認為低氧能刺激P38MAPK的表達，與預處理無關［6］。Sola等［7］通過在體試驗證實，rhEPO通過激活JAK2信號通路，上調其磷酸化水平對腦缺血有保護作用但沒有試驗證實rhEPO與P38MAPK信號通路的關系。本研究發現，rhEPO預處理后P38MAPK表達增加，給予其抑制劑SB203580后，rhEPO對凋亡相關基因的調節作用消失，細胞凋亡增加，因此我們推斷P38MAPK信號通路在rhEPO對缺氧/復氧損傷的神經細胞保護作用中起到關鍵作用。

總之，rhEPO預處理通過P38MAPK信號通路對缺氧/復氧損傷的SK-N-SH細胞有保護作用，但在預處理過程中P38MAPK通路的上下游物質及這一通路與其他信號轉導通路的相互協同作用還有待進一步的研究。

［1］李琴，郭云良，李震，等.胡黃連苷Ⅱ對大鼠腦缺血/再灌注損傷Caspase-3和PARP表達的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):342-345.

［2］Chen G，Zhang S，Shi J，et al.Effects of recombinant human erythropoietin(rhEPO)on JAK2/STAT3 pathway and endothelial apoptosis in the rabbit basilar artery after subarachnoid hemorrhage［J］.Cytokine，2009，45(3):162-168.

［3］Liao ZB，Zhi XG，Shi QH，et al.Recombinant human erythropoietinadministration protects cortical neurons from traumatic brain injury in rats［J］.Eur J Neurol，2008，15(2):140-149.

［4］袁國強，王玲玲，楊海濤，等.P38MAPK通路在TNF-α誘導人臍靜脈內皮細胞分泌ET-1與eNOS中的作用及通心絡干預影響［J］.中國藥理學通報，2009，25(11):1415-1420.

［5］Salnikow K，Donald SP，Bruick RK，et al.Depletion of intracellu-lar ascorbate by the carcinogenicmetals nickel and cobalt results in the induction of hypoxic stress［J］.J Biol Chem，2004，279(39):40337-40344.

［6］Sun XC，Li WB，Li QJ，et al.Limb ischemic preconditioning induces brain ischemic tolerance via P38MAPK ［J］.Brain Res，2006，1084(1):165-174.

［7］Sola A，Rogido M，Lee BH，et al.Erythropoietin after focal cerebral ischemia activates the Janus kinase-signal transducer and activator of transcription signaling pathway and improves brain injury in postnatal day 7 rats［J］.Pediatr Res，2005，57(4):481-487.