大鼠胰腺原位灌注實驗模型的建立及可行性研究

孫富軍，李代清，張秋梅，湯云昭，郭 剛

(1天津醫科大學內分泌研究所，天津300070;2天津醫科大學代謝病醫院)

由于整個機體與器官間的相互影響，在活體內進行某一器官的生理學和藥理學研究非常困難。胰腺離體灌注作為一種體外技術可有效排除體內其他因素干擾，較準確評價研究因素對胰腺組織中胰島β細胞分泌功能的影響。有關大鼠胰腺整體組織不離體情況下進行灌注實驗的可行性鮮見報道。2010年3月，我們采用不離體方式對大鼠胰腺整體組織進行灌注實驗，并用L型鈣通道阻滯劑——依拉地平對其可行性進行了驗證。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠10只，8周齡，體質量220～250 g，適應性飼養1周;戊巴比妥鈉，依拉地平(英國Tocris公司)，125I胰島素放射免疫分析藥盒;Modified Krebs-Ringer HEPES緩沖液(調節pH值至7.4)，分別加入葡萄糖制成低糖灌注液(含3.3 mmol/L葡萄糖)和高糖灌注液(含16.7 mmol/L葡萄糖)，在后者中加入50 nmol/L依拉地平制成依拉地平—高糖灌注液;聚乙烯管，雙顯恒溫加熱器SH-3，快速恒溫數顯水箱HH-42，蠕動泵，拜安易血糖儀。

1.2 動物分組及灌注模型制備 將10只大鼠隨機分為觀察組和對照組各5只，并進行下列處理:禁食12 h，自由飲水，用戊巴比妥鈉(40mg/kg)行腹腔注射麻醉，按文獻［1，2］操作步驟將胰腺與脾、胃和結腸等組織器官分離;在腹主動脈的腹腔干上方結扎，在腸系膜上動脈開口下方1cm處腹主動脈壁上剪一切口，置入灌注管并固定;于門靜脈肝門分叉處剪一切口，插管并固定，插管導出體外后將腹部切口縫合;啟動蠕動泵通過腹主動脈插管向胰腺組織灌注肝素生理鹽水，至門靜脈流出液清亮。

1.3 胰腺原位灌注和胰島素分泌參數檢測 將兩組大鼠放在37℃恒溫加熱器上保溫，按圖1連接蠕動泵，先用37℃ Modified Krebs-Ringer HEPES緩沖液以1 ml/min流速預灌注40min，使胰腺組織的溫度和功能狀態近似生理水平。其后觀察組分別以低糖灌注液灌注10min、依拉地平—高糖灌注液灌注25min，對照組分別以低糖灌注液灌注10min、高糖灌注液灌注25min。用4℃預冷并加有20 μl抑肽酶(濃度為250 μg/ml)的 eppendorf管收集兩組門靜脈插管的流出液，-20℃保存。用放射免疫分析法檢測上述門靜脈流出液中胰島素水平，計算下列指標:胰島素分泌率=每分鐘胰腺流出液中胰島素濃度×灌注流速，基礎胰島素分泌率=低糖灌注液灌注期間胰島素曲線下面積÷灌注時間;葡萄糖刺激的胰島素分泌率=高糖灌注液灌注期間胰島素曲線下面積÷灌注時間［1］。

圖1 大鼠胰腺原位灌注裝置簡圖

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件包進行統計學處理。計量資料以±s表示，組間比較采用配對t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

兩組胰腺胰島素分泌參數見表1，胰腺原位灌注后胰島素分泌曲線見圖2。

表1 兩組胰腺胰島素分泌參數比較(μIU/min，±s)

表1 兩組胰腺胰島素分泌參數比較(μIU/min，±s)

注:與對照組比較，▲P＜0.01

組別 n基礎分泌率 分泌峰值 第1時相分泌率(第11～15min)第2時相分泌率(第16～35min)觀察組 5 206±20 519±37▲ 391±21▲ 322±33▲對照組 5 201±17 1 041±116 715±33 530±36 P值0.671 0.001 0.000 0.000

圖2 大鼠胰腺原位灌注后胰島素分泌曲線

3 討論

大鼠胰腺離體灌注技術是指將胰腺與脾、胃和結腸等組織器官分離后，從腹腔內取出并轉移至一個裝有37℃緩沖液的恒溫容器中，再通過特定實驗裝置自腹主動脈插管泵入灌注液，在門靜脈插管收集流出液，進而對胰腺進行單獨研究的灌注實驗［2］。該實驗主要用于糖尿病及其相關疾病大鼠模型胰島功能的研究，可較準確評價研究因素對胰腺組織中胰島β細胞分泌功能的影響。大鼠胰腺原位灌注技術指在成功實施胰腺分離術后，不將胰腺取出體外進行操作，經腹主動脈插管后直接對胰腺進行灌注，此可避免將胰腺取出體外操作時可能對胰腺組織造成的機械性損傷，使胰腺組織完整性更有保障。

胰島β細胞對胞外葡萄糖濃度變化十分敏感。葡萄糖濃度升高時，β細胞通過膜上的葡萄糖轉運體攝入葡萄糖，經代謝使胞內ATP/ADP比率增加，導致ATP敏感的鉀通道(KATP)關閉，細胞膜去極化，電壓依賴型鈣通道開放，Ca2+內流，胞內Ca2+濃度升高，觸發胰島素釋放，其中第1時相反映在急性刺激下胰島β細胞貯存顆粒中胰島素快速釋放能力;第2時相持續時間長、分泌總量大，反映胰島β細胞持續分泌胰島素的能力。L型鈣通道是人和大鼠胰島 β 細胞上主要的鈣離子通道［3，4］，在胰島素分泌過程中發揮重要作用;依拉地平是一種L型鈣通道阻滯劑，可使鈣離子內流受阻、β細胞胰島素分泌受抑。本研究顯示，①兩組基礎胰島素分泌率無顯著差異，均呈現低水平狀態。②對照組在第1時相胰島素分泌水平迅速升高，分泌高峰出現在第12min，隨后迅速下降，并在一個較高水平穩定波動(即第2時相);觀察組胰島素分泌峰值及胰島素第1、2時相分泌率均顯著低于對照組。提示本實驗成功建立了大鼠胰腺原位灌注模型，且可用于胰島β細胞功能及相關藥理學實驗的動態研究。

綜上所述，胰腺原位灌注模型較體外灌注模型更易于操作，且同樣具備可定量、可重復、可動態觀察等優點;此為胰島β細胞功能的研究提供了一種有效實用的方法。

［1］趙乃倩，余葉蓉，譚惠文，等.大鼠胰腺離體灌注技術的建立［J］.中華內分泌代謝雜志，2007，23(5):459-463.

［2］Wargent ET.The measurement of insulin secretion using pancreas perfusion in the rodent［J］.Methods Mol Biol，2009，(560):203-219.

［3］Herbst M，Sasse P，Greger R.Membrane potential dependent modulations of calcium oscillation in insulin-secreting INS-1 cell［J］.Cell Calcim，2002，31(3):115-126.

［4］PolloA，Lovallo M，Biancardi E，et al.Sensitivity to dihydropyridines，omega-conotoxin and noradrenaline reveals multiple high-voltage-activated Ca2+channels in rat insulinnoma and human pancreatic beta-cells［J］.Pfugers Arch，1993，423(5-6):462-471.