甲狀腺素對大鼠胰島β細(xì)胞功能的影響

王 琳，房春燕，康 白，韓慧蓉

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261052)

甲亢患者因甲狀腺激素分泌增多，葡萄糖代謝異常，升糖作用加強(qiáng)而出現(xiàn)高血糖;其代謝旺盛，胰島素(INS)分泌相對不足，血糖升高，還可造成胰島β細(xì)胞形態(tài)與功能損傷，導(dǎo)致糖耐量異常［1］。2008年，我們觀察了不同劑量甲狀腺素(T4)連續(xù)灌胃后，大鼠血清INS、空腹血糖(FPG)及胰腺細(xì)胞凋亡相關(guān)因子bax、bcl-2蛋白表達(dá)情況。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器及試劑 健康、清潔級SD成年大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20)g，購于解放軍第89醫(yī)院動物養(yǎng)殖中心。主要儀器:H-7500型透射電子顯微鏡(日本日立);SN-695B型智能免疫γ計數(shù)儀(上海原子核研究所);UV-1700紫外分光光度計(日本島津)。主要試劑:左旋甲狀腺素鈉(德國Merck公司);INS試劑盒(北京原子能醫(yī)學(xué)科學(xué)院);SABC免疫組化試劑盒、抗胰島素抗體、濃縮型DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 實驗方法 將大鼠隨機(jī)分為對照組［生理鹽水 10 ml/(kg·d)］、低劑量組［T4100 μg/(kg·d)］、高劑量組［T4600 μg/(kg·d)］各20 只，每日9:00灌胃給藥，連續(xù)用藥20 d。禁食24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥麻醉大鼠，由頸動脈取血5 ml，室溫靜置20 min，1 500 r/min離心15 min，分離血清置－20℃冰箱中保存。分別用放射免疫分析法、葡萄糖酶法檢測血清INS、FPG。處死大鼠后迅速打開腹腔，于胰腺尾部作橫斷面，取出胰尾組織，用刀片快速切成1 cm×1 cm×1 cm大小的組織塊;用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后，馬上置于Bouin's液中固定約24 h，將固定好的組織塊進(jìn)行脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烤片后，以免疫組化法染色，進(jìn)行光鏡樣本制備。采用IpWin51C圖像分析系統(tǒng)對染色陽性物質(zhì)(棕黃色、棕褐色)行吸光光密度測定，以平均光密度值表示bax、bcl-2蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較用Dunnett法分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰島形態(tài)及bax、bcl-2表達(dá) ①胰島形態(tài):對照組胰島數(shù)量較多，島形較飽滿，輪廓較清晰，胰島周邊細(xì)胞數(shù)量較多，島細(xì)胞分布均勻;低劑量組胰島島形不飽滿，輪廓不清晰，邊緣不規(guī)整，胰島周邊細(xì)胞數(shù)量較少，島細(xì)胞分布不均勻，β細(xì)胞少于對照組(P＜0.05);高劑量組胰島島形不飽滿，輪廓不清晰，邊緣不規(guī)整，胰島周邊細(xì)胞數(shù)量較少，島細(xì)胞分布不均勻，β細(xì)胞明顯少于對照組(P＜0.05)。②bax表達(dá):對照組未見bax表達(dá);低劑量組可見bax表達(dá)，主要分布在閏管、腺泡處，胰島部位表達(dá)較少，胞質(zhì)為淺棕黃色;高劑量組bax表達(dá)明顯，主要分布在胰島處，腺泡及閏管處也可見到、但表達(dá)不多，胞質(zhì)為深棕黃色。③bcl-2表達(dá):對照組未見bcl-2表達(dá);低劑量組、高劑量組bax-2未見明顯表達(dá)。

2.2 各組INS、FPG、bax、bcl-2蛋白表達(dá) 見表1。

3 討論

臨床上，甲亢患者除甲亢癥狀外，還有FPG升高、INS降低等糖尿病癥狀。FPG升高可能與胰島β細(xì)胞功能降低有關(guān)。INS升高是早期胰島β細(xì)胞功能受損的標(biāo)志;另外，外周組織葡萄糖利用降低，肝臟葡萄糖代謝異常，腸道葡萄糖吸收異常等都可引起血糖升高。葡萄糖是INS分泌的主要刺激物，長期高血糖對胰島β細(xì)胞有毒性作用，主要包括高血糖刺激的INS分泌敏感性降低及β細(xì)胞耗竭兩方面。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖積聚超過葡萄糖分解能量時，可形成穩(wěn)定的不可逆晚期糖基化終末產(chǎn)物，此時體內(nèi)胰島β細(xì)胞等組織含有相應(yīng)受體，晚期糖基化終末產(chǎn)物與其受體結(jié)合后產(chǎn)生多種氧化應(yīng)激產(chǎn)物［2］;由于胰島β細(xì)胞中的抗氧化酶含量很少，故易受氧化應(yīng)激產(chǎn)物的損傷。本實驗結(jié)果顯示，大鼠采用T4灌胃，其INS降低，F(xiàn)PG升高;說明長期大劑量應(yīng)用T4可影響機(jī)體的糖代謝，使FPG升高，INS降低。

表1 各組 INS、FPG、bax、bcl-2 蛋白表達(dá)(±s)

表1 各組 INS、FPG、bax、bcl-2 蛋白表達(dá)(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 n INS(mIU/L) FPG(mmol/L)bax bcl-2對照組 20 24.90 ±4.95 4.15 ±0.59 0.000 1 ±0.001 2 0.00012 ±0.001 189低劑量組 20 26.70 ±8.32 4.33 ±0.31 0.001 0 ±0.002 6* 0.000 19 ±0.002 358高劑量組 20 18.40 ±3.44* 4.86 ±0.31* 0.012 4 ±0.011 1*0.000 26 ±0.004 516

bax與bcl-2同屬bcl-2基因家族，二者之間可能存在平衡關(guān)系，二者表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可形成同源二聚體 bcl-2/bcl-2、bax/bax或異源二聚體 bcl-2/bax，并抑制或促進(jìn)凋亡發(fā)生［3］。bax、bcl-2 因子任一表達(dá)增多或降低都可使其平衡異常，出現(xiàn)不同的細(xì)胞凋亡結(jié)果。凋亡因子bax大量表達(dá)時，提示胰島β細(xì)胞有不同程度的損傷;胰島β細(xì)胞損傷勢必引起INS分泌減少，使FPG升高。本實驗結(jié)果表明，T4低劑量組、高劑量組bax蛋白表達(dá)均增多，而其bcl-2未見明顯表達(dá)，提示大劑量T4可引起胰島β細(xì)胞凋亡。由此可推斷，長期大劑量應(yīng)用T4可使胰島β細(xì)胞凋亡，此可為臨床用藥及疾病的診治提供理論依據(jù)。

［1］Liu D，Darville M，Eizirik DL.Double-stranded ribonucleic acid(RNA)induces beta-cell Fas messenger RNA expression and increases cytokine-induced beta-cell apoptosis［J］.Endocrinology，2003，142(6):2593-2599.

［2］Kim WH，Lee JW，Suh YH，et al.Exposure to chronic high glucose induces beta-cell apoptosis through decreased interaction of glucokinase with mitochondria:down regulation of glucokinase in pancreatic beta-cell［J］.Diabetes，2005，54(9):2602-2611.

［3］Rawat S，Gray C，Johnson TS，et al.Apoptosis and expression of bcl-2 and bax in cyclosporine-induced experimental renal fibrosis［J］.Transplant Proc，2003，35(1):187-188.