化學去細胞異體神經移植修復鼠全面神經的實驗研究

趙 斌，楊 昱，詹勝鋒，彭 江，王 玉，趙 喆，任志午，張 莉，許文靜，盧世璧

(中國人民解放軍總醫院，北京100853)

化學去細胞同種異體神經(CEAN)最大限度去除了免疫原性物質，同時較完好地保存了神經內部結構和細胞外基質的活性成分，可作為自體神經移植的替代材料。然而，前期研究［1，2］局限于單根單支周圍神經的長度，對于復雜部位的周圍神經缺損的修復，如具有叢狀結構的臂叢神經缺損、“一主干多分支”的神經(如尺神經手部分支、面神經)缺損，國內外鮮有報道。本研究嘗試運用化學萃取法處理大鼠全面神經，修復大鼠全面神經10 mm缺損，探討CEAN修復特殊部位周圍神經缺損的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、設備 成年SD大鼠40只，體質量(250±20)g，由解放軍總醫院實驗動物中心提供。Triton X-100液、脫氧膽酸鈉、熒光金、快藍(美國Sigma公司)，愛德華牌TSJ-1A型自動組織脫水機(天津天利航空機電公司)，BMJ-1型組織包埋機(天津天利航空機電公司)，Leitz 1516型組織切片機(德國Leica公司)，BH-2 OLYMPUS生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 化學去細胞同種異體面神經制備 取5只SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下取雙側面神經，長約15 mm，去除神經周圍外膜，采用0.4%脫氧膽酸鈉與0.3%Triton X-100處理坐骨神經制備CEAN，60Co輻照1 h，置于2 ml PBS液(pH 7.4)4℃儲存備用。

1.3 自體面神經凍融處理 在無菌條件下取5只SD大鼠雙側面神經，將切斷的全面神經放入裝有10%甘油凍存管，紗布包裹后放入液氮3 min，再將凍存管于37℃水浴3 min，取出面神經，生理鹽水沖洗后4℃儲存備用。

1.4 面神經缺損動物模型制備及分組 取30只SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下顯露左側面神經主干及5個分支，近端切斷面神經主干，從該斷點至各分支10 mm處切斷各分支，造成各分支10 mm的缺損。將大鼠隨機分為A、B、C 3組(n=10)，即自體全面神經移植組(A組)、化學去細胞同種異體全面神經移植(CEANA)組(B組)和自體全面神經經液氮凍融后回植組(C組)，各組分籠飼養。

1.5 觀測指標

1.5.1 去細胞程度觀察 分別切取上述化學去細胞同種異體全面神經、正常大鼠全面神經和凍融處理后自體面神經的主干及5個分支(顳支、顴支、頰支、下頜緣支、頸支)，各約2 mm。神經標本行橫向冰凍切片，片厚10μm。切片室溫放置30 min后入4℃丙酮固定10 min。PBS液洗5 min×3次。滴加Hochest-33258熒光染料，染色5 min。PBS液洗5 min×3次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、比較神經內細胞的殘留情況及保留結構程度。

1.5.2 術后一般情況和功能評價 觀察術后大鼠精神狀態、傷口情況、面部皮膚色澤、面部表情是否左右對稱、眼裂大小、觸須動度等。

1.5.3 免疫熒光染色 術后12周，SD大鼠麻醉后取出左側面神經，分別切取移植物的主干及5個分支末端2 mm的神經組織，垂直于神經軸向切片，片厚5μm，每段神經切2張切片，對切片進行神經纖維細絲蛋白(NF200)和神經生長因子受體(P75)的免疫熒光染色，切片室溫放置30 min，入4℃丙酮溶液固定10 min后，PBS液洗5 min×3次。3%H O孵育5～10 min。蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5 min。滴加NF200鼠抗人一抗(1∶200)，4℃過夜。PBS液洗5 min×3次。滴加FITC(1∶100，綠色)標記抗鼠IgG，避光40 min。PBS液洗5 min×3次。滴加P75兔抗人一抗(1∶200)，37℃ 1 h，PBS液洗5 min×3次。滴加TRITC(1∶100，紅色)標記抗兔IgG稀釋，避光40 min。PBS液洗5 min×3次，封片，熒光顯微鏡下觀察神經橫截面上神經纖維和雪旺細胞的生長情況。

2 結果

2.1 CEAN大鼠全面神經形態和組織學觀察 大體觀察可見化學去細胞同種異體全面神經長度較之前縮短，外膜光滑，略通透，質地較韌。Hochest-33258熒光染色后，可見萃取前新鮮大鼠面神經內有大量細胞存在，其細胞核被熒光染料染成藍色;而CEAN內，藍色亮點幾乎不可見，即細胞去除干凈，CEAN結構完整。而液氮凍融后面神經內可見大量細胞碎片，神經結構破壞嚴重。

2.2 術后一般情況和功能評價 術后3 d，各組大鼠精神狀態良好，傷口處稍紅腫，傷口干燥，無血性及膿性分泌物。靜息狀態下面部表情不對稱，鼻尖歪向健側(右側);活動狀態下術側(左側)觸須動度明顯弱于健側。且各組大鼠間無明顯差異。術后12周，靜息狀態下大鼠面部表情左右對稱，無明顯歪斜;活動狀態下，兩側觸須動度基本一致。

2.3 再生神經的大體形態 術后12周取材，觀察到自體面神經移植組神經組織與周圍組織輕微粘連，有少量瘢痕形成;移植物及遠、近段神經呈正常外觀，白色較韌，有光澤，無萎縮;神經吻合口無膨大，連續性良好。CEANA組和凍融組神經組織與周圍組織粘連較重，但較易分離，少量瘢痕形成;吻合口處稍膨大，移植物與兩端受體神經粗細一致，顏色相近，質地較韌。

2.4 免疫熒光染色 NF200和P75免疫熒光染色可見3組移植的全面神經其5個分支遠端均有大量新生的神經纖維和大量新生的梭形雪旺細胞，部分新生的神經纖維周圍包繞新生的雪旺細胞。各組大鼠間無明顯差異。術后12周，A組、B組有髓神經纖維總數均優于C組(P＜0.05)，A組與B組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 術后12周各組大鼠面神經各支有髓神經纖維計數(±s)

表1 術后12周各組大鼠面神經各支有髓神經纖維計數(±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，△P ＜0.05

組別 主干 顳支 顴支 頰支 下頜緣 頸支A組 2 309±246 1 501±130 1 664±124 2 025±150 1 876±911 401±121 B組 2 223±224* 1 374±124* 1 651±113* 2 015±158* 1 769±131* 1 298±89*C組 2 031±179＊△ 1 363±158＊△ 1 554±87＊△ 1 862±159＊△ 1 757±137＊△ 1 303±72＊△

3 討論

對于特殊部位具有特殊結構的周圍神經，如面神經“一主干五分支”結構，難以找到自體能夠匹配的供體神經，而異種神經存在較強的排斥反應。另外，目前利用組織工程的方法還無法做出“一主干五分支”且與缺損相匹配的結構［3］。同種異體神經的出現解決了以上難題，而且保留了神經的獨特結構，其天然的仿生性是其他任何移植替代材料所無法比擬的。

本研究結果顯示，CEANA結構保存完整，而液氮凍融后結構破壞嚴重。證實了凍融法雖然能殺死細胞、去除免疫原性，但不能清除細胞碎片，且引起基底膜碎裂。由于細胞碎片的存在，在修復過程中巨噬細胞和雪旺氏細胞侵入基底膜管進行吞噬，這種細胞侵入在神經再生的早期起阻礙作用，且進一步破壞基底膜［4］。

化學萃取法主要是使用各種化學去污劑破壞掉雪旺細胞和髓鞘，并清除細胞碎片及髓鞘的殘留物，保留神經外膜、束膜和內膜形成的管柱狀結構和雪旺細胞基底板層及其主要成分［5］，具有其他替代材料無法比擬的優越性，成為修復周圍神經缺損理想材料之一，體現出此種結構的同種異體神經的獨一無二性，其內部天然的基底膜特殊結構，比單根單支周圍神經的基底膜結構更為復雜，且在神經損傷后再生的過程中，對于基底膜的完整性要求更高，而傳統的物理去除免疫原性方法，對單根單支周圍神經的基底膜結構破壞都很嚴重，更難達到此種特殊結構周圍神經的“高標準”，勢必遭到淘汰。

本研究中術后12周結果顯示，3組再生的面神經均由主干沿著“一主干五分支”的特殊結構順利通過10 mm的缺損，成功長入終末靶器官。且CEANA組再生有髓神經纖維計數明顯優于自體面神經液氮凍融后回植組的修復效果。

總之，CEANA對于特殊部位具有特殊“一主干多分支”結構的周圍神經而言，是其他任何移植材料都無法比擬和替代的，在今后臨床復雜的周圍神經損傷病例中，CEANA的優越性將逐步體現，最終得到廣泛應用。

［1］Yu H，Peng J，Guo Q，et al.Improvement of peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts with local released of nerve growth factor［J］.Microsurgery，2009，29(4):330-336.

［2］Li Z，Peng J，Wang G，et al.Effects of local release of hepatocyte growth factor on peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts［J］.Exp Neurol，2008，214(1):47-54.

［3］Hudson TW，Evans GR，Schmidt CE.Engineering strategies for peripheral nerve repair［J］.Orthop Clin North Am，2000，31(3):485-498.

［4］王冠軍，孫明學，盧世璧，等.改良化學去細胞同種異體神經制備方法的實驗研究［J］.中國矯形外科雜志，2007，15(12):929-932.

［5］孫明學，王鑫，趙斌，等.化學去細胞法對粗大神經質量評價方法及影響因素的探討［J］.中國修復重建外科雜志，2008，22(11):1373-1377.