骨形態(tài)發(fā)生蛋白微球?qū)θ撬杌|(zhì)細(xì)胞增殖和分化的影響

姚 琦，姜 華，張立海，黃 鵬，崔 庚，唐佩福

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京100038;2中國人民解放軍總醫(yī)院)

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)等外源性生長因子的應(yīng)用研究一直是組織修復(fù)再生和組織工程領(lǐng)域最活躍的課題之一。國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量生長因子緩釋載體的研究［1～3］，其中聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)不但具有生物相溶性好、無免疫反應(yīng)等特點(diǎn)，而且可通過調(diào)節(jié)乳酸和乙醇酸二單體的比例得到不同降解速率的載體材料，因而目前被廣泛用作藥物載體材料。本實(shí)驗(yàn)于2010年完成，旨在觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白微球?qū)w外培養(yǎng)的犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)增殖及分化影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PLGA購自山東省醫(yī)療器械研究所;rhBMP-2購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;hhuyuyzaz肝素、抗壞血酸、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶、牛血清白蛋白購自美國Sigma公司;堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自南京建成生物制品公司;PVA聚乙烯醇、二氯甲烷購自北京化學(xué)試劑公司;Ⅰ型膠原免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白微球制備 復(fù)乳—溶劑揮發(fā)法［4］制備微球，rhBMP-2干粉10 mg用鹽酸胍溶液溶解，取出100μl PBS的rhBMP-2溶液，并加適量的牛血清白蛋白做保護(hù)劑，混勻，形成內(nèi)水相，100 mg的PLGA溶于0.7 ml二氯甲烷中形成油相(含2.5%司盤－20)，內(nèi)水相加入油相中冰浴超聲乳化，形成初乳，將初乳加入到10ml外水相中(含1%PVA、0.5%吐溫 －20)，800 r/min攪拌 4 h揮盡溶劑，過濾，蒸餾水洗滌，真空凍干，4～8℃儲(chǔ)存。

1.2.2 犬MSC的分離與培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10%戊巴比妥鈉25 mg/kg靜脈麻醉，腰骶部剃毛、消毒、鋪巾。以雙側(cè)髂后上棘連線中點(diǎn)為穿刺點(diǎn)，16號(hào)骨髓穿刺針用肝素鈉稀釋液預(yù)濕后刺入皮下。確定髂后上棘進(jìn)針點(diǎn)，輕度斜向尾側(cè)進(jìn)針3～4 mm，檢查穿刺針固定于髂骨上。取出針芯，連接10 ml注射器，內(nèi)含肝素鈉稀釋液1 ml抽取骨髓液3～4 ml。穿刺針退至皮下，同法抽取對(duì)側(cè)髂骨骨髓液3～4 ml。將骨髓液緩慢貼壁加入預(yù)裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管，900 g離心30 min。輕輕用吸管沿試管周緣吸取收集中間云霧狀的白膜層(單核細(xì)胞層)，用5倍體積以上的 Hank’s液稀釋后，混勻，900 g離心10 min。細(xì)胞重懸后再次洗滌離心1次。收集細(xì)胞沉淀，用含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液混勻后將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，將調(diào)整好濃度的單個(gè)細(xì)胞按4×105/cm2底面積接種于6～8個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。4 d后首次換液。此后每4 d換液1次，篩除未貼壁生長的細(xì)胞。一般48 h后，有少量細(xì)胞貼壁，成仿錘形，4 d左右出現(xiàn)克隆，7 d出現(xiàn)致密貼壁層，10 d后貼壁細(xì)胞匯合可達(dá)80% ～90%。取胰蛋白酶250 mg，加入PBS溶液100 ml溶解，工作濃度為0.25%，無菌過濾分裝，冰箱－20℃冷凍保存，使用前37℃水浴復(fù)溫。倒置相差顯微鏡下觀察原代細(xì)胞匯合達(dá)90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代。棄去瓶中培養(yǎng)液，Hank’s液洗滌1次，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml，室溫下消化作用60～90 s。倒出消化液，加入含15%FBS的DMEM 10 ml，用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)輕輕吹打瓶底貼壁細(xì)胞，使之形成細(xì)胞懸液。將其2/3量平均分至2個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，傳至3代待用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組(rhBMP-2/PLGA微球):根據(jù)其包封率及載藥率計(jì)算加入同等量的rhBMP-2的載藥微球，最終DMEM培養(yǎng)液中rhBMP-2濃度為1μg/ml。空白對(duì)照組:不含任何材料。

1.2.4 對(duì)MSC增殖的影響 取3塊96孔板，實(shí)驗(yàn)組含rhBMP-2微球培養(yǎng)液，濃度設(shè)為1μg/ml。取生長良好的第3代MSC，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個(gè)/ml，接種細(xì)胞于含10%FBS的DMEM中，每孔2×103個(gè)，每孔體積100μl。對(duì)照組僅加培養(yǎng)液，分別在第1、3、5天各取1板，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，然后用酶聯(lián)檢測儀在490 nm波長檢測光密度值(OD)，取4孔平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以反映其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.2.5 對(duì)MSC分化的影響 細(xì)胞接種及實(shí)驗(yàn)分組同上。ALP檢測:在上述相同時(shí)間點(diǎn)棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl 0.1%TritonX-100細(xì)胞裂解液，4℃過夜。混勻后用酶聯(lián)檢測儀檢測OD，進(jìn)而測定其ALP。

1.2.6 對(duì)MSC中Ⅰ型膠原表達(dá)的影響 3%H2O2室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水洗3次;滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體;滴加適當(dāng)稀釋的一抗，37℃孵育2 h，PBS洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min PBS洗2 min×3次;滴加SABC試劑20～37℃ 20 min，PBS洗2 min×4次;使用DAB顯色試劑盒顯色:將試劑盒中A、B、C試劑各1滴加入1 m l蒸餾水中，混勻后滴加至爬片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌;脫水，透明，封片，顯微鏡觀察染色結(jié)果并照相。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MSC形態(tài)學(xué)觀察 原代體外培養(yǎng)的犬MSC接種后的最初72 h，培養(yǎng)液中的細(xì)胞成分以不貼壁的單核細(xì)胞增多，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，這些細(xì)胞逐漸壞死破碎或經(jīng)過1～2次換液，已基本篩除。4 h開始貼壁，24 h有少數(shù)細(xì)胞貼壁，48 h后貼壁細(xì)胞明顯增多，并開始分裂增殖，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞梭形外觀。5～7 d，造血細(xì)胞成分已基本消失，貼壁細(xì)胞體積增大，多為梭形，帶有粗大突起，有些則為三角形或多角形，隨著貼壁細(xì)胞增多，形態(tài)變?yōu)殚L梭形，呈成纖維樣改變。原代生長較慢，常需10 d左右長滿瓶底，一旦開始傳代生長速度明顯加快，在培養(yǎng)瓶中均勻生長，漩渦樣匯合，緊密貼壁，呈草束狀排列。FS為半透明凝膠，通過倒置顯微鏡可以觀察到各組細(xì)胞與FS融合生長，難以區(qū)分。

2.2 對(duì)MSC增殖與分化的影響 見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MSC增殖與分化比較(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MSC增殖與分化比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01

組別 MSC 增殖第1天 第3天 第5天活性第1天 第3天ALP對(duì)照組 0.07 ±0.02 1.02 ±0.07 2.05 ±0.12 0.26 ±0.03 0.30 ±0.09實(shí)驗(yàn)組 0.08 ±0.01 1.03 ±0.11 2.05 ±0.11 0.27 ±0.01 0.43 ±0.12*

2.3 Ⅰ型膠原表達(dá) 正常MSC細(xì)胞質(zhì)中有Ⅰ型膠原表達(dá)，但含量較低，而采用rhBMP-2微球作用后的MSC陽染顆粒增多，染色明顯。

3 討論

大多數(shù)研究認(rèn)為BMP對(duì)細(xì)胞增殖的作用不明顯，但卻具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)MSC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用［5］，甚至有研究報(bào)道BMP抑制MSC細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴性［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示rhBMP-2/PLGA微球MSC增殖作用不明顯，可見rhBMP-2是一種強(qiáng)促分化劑，并不促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

rhBMP-2有促進(jìn)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞、骨系細(xì)胞的募集和分化及誘導(dǎo)體外成骨的能力。無論是對(duì)于MSC還是原代胚胎大鼠顱骨成骨細(xì)胞，rhBMP-2都可促進(jìn)體外成骨，即鈣結(jié)節(jié)的生成，增加成骨細(xì)胞標(biāo)記酶—ALP的活性，以及促進(jìn)標(biāo)志骨細(xì)胞分化基因的表達(dá)，如促進(jìn)I型膠原、ALP、骨鈣素和骨涎液蛋白的分泌及mRNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞ALP、I型膠原蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，結(jié)合BMP體外釋放測定結(jié)果分析，說明釋放rhBMP-2仍保持其誘導(dǎo)成骨分化的活性。

綜上所述，我們所制備的rhBMP-2/PLGA微球具有良好的生物相容性，并可為MSC的生長提供良好的環(huán)境，能被用來作為細(xì)胞因子的載體或支架應(yīng)用于臨床及實(shí)驗(yàn)中。

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