大黃素體外逆轉口腔鱗癌耐藥細胞株KBV200的機制初步探討

歐冰凝，唐海樺，張海英，梁 鋼*，韋 艷

(1廣西醫科大學藥學院，南寧530021;2廣西醫科大學公共衛生學院)

多藥耐藥 (MDR)是腫瘤化療失敗的重要原因，逆轉腫瘤MDR是提高其化療效果的關鍵。研究發現大黃素(EM)能逆轉人乳腺癌細胞MCF-7/Adr、人膽管癌多藥耐藥細胞QBC939/ADM對阿霉素的抗藥性［1～4］，其逆轉人口腔鱗癌耐藥細胞株的研究還未見有報道。本研究主要探討EM對人口腔鱗癌耐藥細胞株KBV200的體外MDR逆轉作用及作用機制，為進一步開展體內逆轉作用研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人口腔鱗癌細胞 KB及其耐藥株KBV200購自南京凱基生物科技發展有限公司，置37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養基培養，KBV200細胞培養時加入200 ng/ml VCR維持其耐藥性，實驗前1～2周停藥。0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.1.2 主要抗體及藥物 P-gp鼠抗人單克隆抗體購自SANTA公司，肺耐藥相關蛋白(LRP)鼠抗人單克隆抗體購自NeoMarkers公司，TOPO-Ⅱ鼠抗人單克隆抗體、P53鼠抗人單克隆抗體、Bax兔抗人多克隆抗體、Bcl-2鼠抗人單克隆抗體、GST-π鼠抗人單克隆抗體和即用型非生物素免疫組化ElivisionTM plus檢測試劑盒均購自福州邁新，DAB顯色劑、辣根酶標記羊抗鼠-HRP購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EM對KBV200細胞株的逆轉作用 選取EM 3個對KBV200抑制率低于10%的藥物濃度為實驗濃度。取單細胞懸液1×105/ml種板，每孔200 μl，設培養液空白對照孔，陰性對照組(無藥作用耐藥細胞)，單用VCR組和聯合用藥組。其中聯合用藥組分為以下4組，A組:0.7μg/ml EM+長春新堿(VCR);B 組:1.0 μg/ml EM+VCR;C 組:1.4 μg/ml EM+VCR;D 組:5.0μg/ml維拉帕米(VRP)+VCR。其中聯合用藥組分別加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/ml VCR。用 MTT測定各孔的 OD 值，細胞抑制率(IR)=(陰性對照組OD值－藥物處理組OD值)/陰性對照組OD值×100%，SPSS13.0軟件求IC50。逆轉耐藥倍數=單用VCR處理KBV200的 IC50/逆轉劑聯合VCR處理KBV200的IC50。

1.2.2 Western blot檢測蛋白P-gp、LRP的表達 2 ml對數生長期的KBV200細胞4×104/ml接種于6孔板，待細胞貼壁后，其中3孔加入終濃度為2.0 μg/ml的VCR，另外3孔加入終濃度為1.0μg/ml的EM和2.0μg/ml的VCR，培養72 h后經裂解、采集、離心后，取上清液進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。P-gp、LRP在7%的分離膠中電泳3 h。將含有蛋白條帶的凝膠轉膜2 h，后將蛋白條帶轉移至硝酸纖維素濾膜中，然后將濾膜在5%的脫脂奶中封閉115 h，加入一抗 (P-gp或LRP鼠抗人單克隆抗體)過夜，加入二抗(辣根酶標記羊抗鼠-HRP)2 h，洗膜后ECL熒光定影，然后在暗室中得到膠片。

1.2.3 免疫細胞化學法(ICC)檢測 P-gp、LRP、GST-π、TOPO-Ⅱ、P53、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達 按試劑盒說明操作，用PBS代替一抗作為陰性對照。取對數生長期KBV200細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，其中3孔加入終濃度為2.0μg/ml的VCR，另外3孔加入終濃度分別為1.0μg/ml和2.0μg/ml的EM和VCR，藥物作用72 h后，取出蓋玻片，PBS沖洗3次;固定液固定10 min;PBS沖洗3次;加50 μl過氧化酶阻斷劑，室溫孵育10 min;PBS沖洗3次;加50μl非免疫動物血清，室溫孵育10 min;棄去血清，加一抗，4℃過夜;PBS沖洗3次;加50μl生物素標記的二抗，室溫孵育10 min;PBS沖洗3次;加50μl鏈酶素抗生物素—過氧化物酶溶液，室溫孵育10min;PBS沖洗3次;加100μl新鮮配制的DAB溶液，顯色，顯微鏡下觀察，自來水沖洗;蘇木素復染，自來水洗;1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗;酒精梯度脫水，二甲苯透明，風干;中性樹膠封片，PIPS-2020超清晰度病理圖文分析系統攝片并檢測細胞染色的平均光密度。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，所得數據以±s表示，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 EM對KBV200的逆轉作用 課題組前期已研究KBV200對 VCR的耐藥倍數為56.70倍［5］。由圖1可知，B組KBV細胞的抑制率比單用VCR組大大增強(P ＜0.01)。A、B、C、D 組對KBV200的耐藥逆轉倍數分別為 1.44、2.87、1.76、1.83 倍，后 3組的逆轉作用與單用VCR組比較均有顯著性差異(P ＜0.05)，B、D 組間亦有顯著性差異(P ＜0.05)。EM對KBV200的逆轉作用無劑量依賴關系。

圖1 各組藥物對KBV200的細胞毒作用

2.2 Western blot法檢測結果 見表1。EM聯合VCR 處理 KBV200 后，P-gp/β-actin 和 LRP/β-actin分別降至單用VCR組的21%和18%。

表1 EM處理前后KBV200細胞中P-gp、LRP 表達比較(±s，n=9)

表1 EM處理前后KBV200細胞中P-gp、LRP 表達比較(±s，n=9)

注:與單用VCR組比較，*P＜0.01

-actin單用VCR組組別 P-gp/β-actin LRP/β 0.837 ±0.017 0.673 ±0.033 EM 聯合 VCR 組 0.176 ±0.009* 0.121 ±0.002*

2.3 ICC檢測結果 見表2。

3 討論

目前認為參與耐藥機制主要有多藥耐藥P-gp、多藥耐藥相關蛋白 (MRP)、LRP、乳腺癌耐藥相關蛋白(BCRP)、抗原加工相關轉運蛋白(TAP)。本文研究細胞非毒性劑量下的EM聯合抗腫瘤藥物VCR對口腔鱗癌耐藥細胞株KBV200的逆轉作用，發現其有細胞毒增敏作用，但逆轉倍數并不是很高(＜6倍)。同時Western blot和ICC兩種方法測得的結果都表明EM不同程度地降低P-pg和LRP的表達。研究表明抑制P-gp的表達和功能從而提高細胞內藥物濃度是EM逆轉MDR的機理之一。故可以認為細胞非毒性劑量下的EM聯合VCR可能通過降低P-gp的表達量，增加細胞內VCR的含量而逆轉KBV200耐藥，LRP表達的改變可能有助于EM在細胞內的分布和化療藥物進入細胞核發揮作用而達到逆轉耐藥的效果。

表2 EM處理前后KBV200細胞中各蛋白吸光度比較(±s，n=9)

表2 EM處理前后KBV200細胞中各蛋白吸光度比較(±s，n=9)

注:與單用VCR組比較，*P＜0.01

組別 P-gp LRP Bcl-2/Bax GST-π P53 TOPO-Ⅱ單用 VCR 組 1.123 ±0.175 1.095 ±0.021 171.60 ±0.30 1.405 ±0.087 0.007 ±0.001 0.005 ±0.006 EM 聯合 VCR 組 0.225 ±0.037* 0.055 ±0.007* 13.80 ±0.20* 1.081 ±0.151 1.033 ±0.166* 0.877 ±0.049*

陳玉英等［6］研究發現大黃素能有效抑制 HL-60/ADR，機制主要通過下調 Bcl-2、c-Myc和Caspase-3前體蛋白表達水平并誘導其凋亡。本文選擇3種細胞凋亡蛋白 P53、Bcl-2和Bax來初步探討EM對KBV200耐藥細胞在細胞凋亡方面的調節作用。結果顯示，EM上調P53的表達，下調Bcl-2/Bax的比值，促進細胞凋亡。本研究結果為進一步對EM進行體內藥效學研究提供實驗依據。

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