廣西肺鱗狀細胞癌RASSF1A及RPRM基因甲基化分析

馮 旭，覃家錦，周華富，鄭寶石，何 巍

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

基因的失活方式有很多，而啟動子CpG島的異常甲基化受到越來越多的重視［1］，最近研究證實啟動子CpG島甲基化可能在非小細胞肺癌(NSCLC)發生發展過程中發揮重要作用并且是導致抑癌基因失活的重要機制［2］。2009年9月～2010年7月，我們通過檢測和比較RASSF1A和RPRM肺癌相關基因啟動子CpG島甲基化在肺鱗狀細胞癌組織以及良性肺部疾病肺組織中的發生頻率，建立廣西肺鱗狀細胞癌相關較為完整的甲基化譜，為臨床早期診斷廣西肺鱗狀細胞癌提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 肺癌組為2008年9月～2009年6月在我院住院的廣西肺鱗狀細胞癌患者30例，其中男21 例、女9 例，年齡(52.3 ±1.2)歲，均經病理確診。對照組為良性肺部疾病患者20例，其中男15例、女5例，年齡(46±1.25)歲，自發性氣胸12例，肺囊腫8例。

1.2 標本采集與處理 肺癌組取手術中病理組織標本及癌旁正常組織，對照組取手術中組織標本，立刻置于液氮罐內，置－80℃低溫冰箱待檢。

1.3 甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測RASSF1A及RPRM ①標本細胞株DNA提取。用1 ml PBS懸浮沉淀物，轉移入1.5 ml的離心管中，離心/去上清后，加入細胞裂解液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris，25 mmol/L EDTA 0.2 ml，0.5%SDS)和終濃度為200μg/ml的proteinase K 0.2 ml。于50℃溫育2 h后，酚/氯仿抽提2次，通過酒精沉淀獲取DNA。加入0.3ml10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH7.5溶解，定量后置－20℃保存。②DNA非甲基化胞嘧啶的處理。亞硫酸氫鈉處理:每個樣品DNA取2μg，加入 ddH2O至總體積20μl，加入3 mol/L NaOH 2.2μl輕輕混勻后置37℃水浴15 min，以使基因組DNA充分變性，分別加入新鮮配制的對苯二氫醌12μl和NaHSO3208μl，混勻后覆蓋消毒后的礦物油快速離心后，50℃反應16 h，使未甲基化的胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶。接著加1μl糖原、8.0 mol/L NH4Ac 44μl及無水乙醇350μl混勻后，13 000 r/min離心6 min，棄去上清液，得到沉淀的DNA甲基化后的反應物，用75%乙醇洗滌沉淀2次，空氣中稍干燥，溶解于200μl ddH2O，置－20℃下保存待檢測。③甲基化后DNA的PCR。按每管中加入2 μl 2 mmol/L dNTP、2 μl 10 ×Buffer、15 μl ddH2O乘以PCR樣本數，在冰浴狀態下加0.12μl Taq酶，輕輕混勻以免降低酶的活性。加入甲基化(M)和去甲基化引物(U)各2μl，輕輕混勻后，加入ddH2O至24μl/管加入到PCR 8連管中，最后加入1 μl處理后DNA模板。④PCR后DNA產物甲基化狀態的檢測。在200～210 V電壓下電泳12 min，PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠上電泳分離，其結果在紫外凝膠成像系統觀察分析并拍照存檔。然后均將PCR產物割膠回收，經測序來證明PCR產物的正確性。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.0進行 χ2檢驗，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

RASSF1A基因和RPRM基因電泳圖分別見圖1、2。肺癌組 RASSF1A基因甲基化率為 83.3%(25/30)，RPRM基因甲基化率為70%(21/30);對照組RASSF1A基因均呈去甲基化，甲基化率為0，RPRM基因甲基化率為10%(2/20)。肺癌組RASSF1A基因與RPRM基因甲基化率與對照組比較均有統計學差異(P＜0.01)。

圖1 RASSF1A基因電泳圖

圖2 RPRM基因電泳圖

3 討論

現代分子生物學認為，腫瘤是一種多基因改變、多步驟發生的全身性疾病，基因的改變在細胞水平表現為細胞周期失常，癌基因的突變或過度表達導致促細胞通路過度活化，引起細胞增殖，肺癌也不例外。雖然經過多年的研究，耗費大量時間和經費，卻發現在相當一部分腫瘤患者的癌細胞中，其主要的基因是完整的，并沒有發現任何突變或缺失等基因變異。更精確、便利的肺癌早期診斷和預后判斷的手段是我們追求的目標。

表觀遺傳學豐富了 Knudson［3］兩次打擊學說，此學說認為抑癌基因的失活應當包括兩個等位基因的共同改變，其中一個等位基因出現雜合性缺失(LOH)，表現為抑癌基因失活可以參與第1、2次打擊，包括基因組水平改變如基因突變和染色體缺失完成以及啟動子區高甲基化，并能通過維持型甲基化酶DNMT1，使特定甲基化模式在細胞世代間遺傳;另一個發生突變或甲基化使基因失表達，該基因無表達活性，表明兩者在腫瘤形成中有相同的生長優勢。因此DNA甲基化使抑癌基因沉默在腫瘤發生發展中具有重要意義，另外認為腫瘤相關基因DNA甲基化改變是腫瘤發生發展中的早期頻發事件。因此DNA異常甲基化的檢測已成為探討腫瘤發生機制新的分子分析熱點。

基因特別是抑癌基因的甲基化是NSCLC預后較差的一個分子信號，Burbee 和 Brabender等［4，5］分別報道發生RAASF1a和RPRM高度甲基化的NSCLC患者的生存期較無甲基化者明顯縮短。余宗濤等［6］發現肺癌組織和外周血漿、支氣管肺泡灌洗液中RASSF1A基因啟動子異常甲基化率為53.3%，非肺癌患者中未檢出甲基化。本實驗結果發現，肺鱗狀細胞癌 RASSF1A基因甲基化率為83.3%，RPRM基因其甲基化率為70%，均明顯高于對照組。證實了在廣西肺鱗狀細胞癌中兩種抑癌基因RASSF1A及RPRM有較高的甲基化率，為臨床上早期診斷肺癌并預測患者的預后提供重要的理論依據。

［1］Li E，Beard C，Jaenisch R.Role for DNA methylation in genomic imprinting［J］.Nature，1993，366(6453):362-365.

［2］Jaenisch R.DNA methylation and imprinting:why bother［J］.Trends Genet，1997，13(8):323-329.

［3］Knudson AG.Two genetic hits(more or less)to cancer［J］.Nat Rev Cancer，2001，1(2):157-162.

［4］Burbee DG，Forgacs E，Zochbauer-Muller S，et al.Epigenetic inactivation of RASSF1a in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression ［J］.JNatl Cancer Inst，2001，93(9):691-699.

［5］Brabender J，Usadel H，Danenberg KD，etal.Adenomatous polyposis coligene promoter hypermethylation in non-small cell lung cancer is associated with survival［J］.Oncogne，2001，20(27):3528-3532.

［6］余宗濤，袁亞莉，張吉才，等.肺癌患者Ras相關區域家族1A基因啟動子異常甲基化的檢測［J］.臨床內科雜志，2007，24(1):23-24.