IVF失敗者子宮內膜galectin-3表達及其容受性評估

趙世彬，甄秀麗*，孫海茹，張 娜，乜照燕，張 軼

(1河北醫科大學第四醫院，石家莊050011;2衡水哈勵遜國際和平醫院)

目前體外受精—胚胎移植(IVF)妊娠率不斷提高，但有患者胚胎評分好仍不能妊娠。這使人們對不孕癥患者著床方面的缺陷越來越重視，著床時胚胎和子宮內膜的同步發育與相互配合是很重要的，其中，子宮內膜的接受性又是一個關健性因素，自然成為一個研究熱點。使用抑制性消減雜交技術［1］(SSH)對差異表達基因片段進行測序，建立了與子宮內膜容受性相關的差異表達基因文庫，篩選出與子宮內膜容受性相關基因，如galectin-3等。本研究通過檢測galectin-3在IVF失敗患者子宮內膜中的表達，探討子宮內膜容受性的分子基礎，為提高IVF妊娠率提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1～4月在河北醫科大學第四醫院生殖醫學科行IVF失敗患者11例作為研究組，不育原因為輸卵管因素9例，子宮內膜異位癥2例。對照組為10例同期行IVF妊娠者，前一周期排卵后6～7 d著床窗口期子宮內膜采用逆轉錄PCR(RT-PCR)技術和免疫組化技術檢測內膜galectin-3表達。患者年齡24～39歲，不孕年限2～10 a。所有入選病例均符合以下條件:排卵前子宮內膜厚度≥8 mm;形態三線或接近三線。

1.2 研究方法

1.2.1 子宮內膜采集 選取有IVF指證者于IVF前一月經周期第10～11日開始監測卵泡，陰道B超采用日本ALOKA公司α-5彩色超聲儀，陰道探頭頻率為5 MHz。排卵后6～7 d用內膜取樣器采集子宮內膜部分液氮保存用于mRNA測定，部分4%甲醛固定用于免疫組化檢測。

1.2.2 控制性超排卵 排卵后6～7 d(黃體中期)給予醋酸曲普瑞林(德國輝凌制藥)0.1 mg/d，達到降調節標準后給予促性腺激素(Gonal-F，瑞士serone公司;hMG，麗珠制藥)，采用經陰道超聲監測子宮內膜變化和卵泡生長情況，當至少有3個卵泡直徑＞18 mm時，當晚注射艾澤(瑞士serone公司)250 IU，注射后38 h左右取卵，體外受精，于取卵后3 d胚胎移植，移植后21 d B超子宮內看到孕囊為臨床妊娠。

1.2.3 子宮內膜RT-PCR檢測技術 分別取研究組及對照組子宮內膜各約50 mg加入Rezol 1 ml置勻漿器內充分勻漿，提取總RNA，取出1.5μg，進行反轉錄得cDNA，繼而進行PCR擴增。galectin-3上游引物序列為:5'-GAATGATGTCTTCCAC-3'，下游引物序列為:5'-CACTGGTGAGGTCTATGTCAC-3'，擴增片段長度為278 bp。同時以擴增片段長度為540 bp的β-actin作為內參照。PCR循環條件為:94℃5 min，1 個循環;94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，30個循環;72℃ 10 min，1個循環。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用VDS圖像分析系統進行照相和圖像分析。IOD值經內參照校正，將校正值進行統計學分析。Rezol及反轉錄試劑盒均為北京賽百盛公司產品，galectin-3、β-actin引物由博亞生物技術公司設計，上海生工生物技術公司合成。

1.2.4 免疫組化檢測 galectin-3鼠單克隆抗體IgG1為CWBIO公司產品。二抗為通用型試劑盒。將子宮內膜用4%甲醛固定后石蠟包埋，制備2μm厚連續組織切片。分別進行HE和ABC免疫組化染色。脫蠟、消化、高壓抗原修復、封閉、加入一抗(單克隆小鼠抗人galectin-3稀釋濃度為1∶100)、二抗、DAB顯色、蘇木素復染、脫水后透明、中性樹膠封片。用PBS代替一抗做陰性對照。顯微鏡觀察并拍照。陽性判斷標準:每張染色片隨機選取5個視野，以背景清晰、細胞質著色呈棕黃色為陽性，分為4個等級:細胞均無任何陽性染色為“－”;25%以下細胞陽性染色為“+”;25% ～50%細胞陽性染色為“++”;50%以上細胞陽性染色“+++”。

1.3 統計學方法 所有數據采用SPSS11.5軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 一般情況比較 研究組與對照組年齡、不育年限、Gn天數、獲卵數、優胚數等均無統計學差異，見表1。

表1 研究組與對照組一般資料比較(±s)

表1 研究組與對照組一般資料比較(±s)

獲卵數 優胚數研究組 29.22 ±4.16 5.12 ±3.16 10.54 ±2.81 11.26 ±2.73組別 年齡(歲)不育年限(a)Gn天數(d)5.32 ±3.13對照組 28.41 ±4.15 4.98 ±4.44 10.44 ±3.13 11.55 ±2.275.19 ±4.25

2.2 galectin-3 mRNA的表達 見圖1。PCR半定量分析結果顯示，galectin-3 mRNA在研究組和對照組分別為0.11 ±0.18 和0.42 ±0.37，P ＜0.01。

圖1 2組著床窗口期子宮內膜galectin-3 mRNA表達比較

2.3 galectin-3蛋白的表達 galectin-3蛋白在腺體上皮細胞和基質細胞均有表達，研究組的表達為“－”，對照組的表達為“++”。

3 討論

胚胎著床的成功依賴于子宮內膜和胚胎的同步發育，子宮內膜僅在特定而短暫的時期允許胚胎著床，這一時期被稱為“著床窗口期”，人類胚胎著床窗口期在排卵后第6～8天，即分泌中期。子宮內膜容受性是受到母體激素作用下子宮內膜局部因子的一系列時序性表達的基因調控，已經發現一些基因與子宮內膜容受性建立有關，如細胞因子、黏附分子、糖復合物等。

在對胚泡著床的研究過程中，糖蛋白復合物的作用一直頗受重視，人們認為這類物質可以調節子宮內膜的增殖、分化、遷移及黏附能力，而且胚胎和子宮內膜的相互識別過程也可能通過糖復合物及其配體的相互作用建立。galectins是糖結合蛋白的一個家族，galectin-3是該家族的主要成員之一［2］，這類分子一方面通過與配體結合調節細胞生長、黏附和侵襲，同時又具有調節整聯蛋白與細胞外基質分子的親和力的作用，galectin-3可與整聯蛋白α1β1結合［3］。雷彩霞等［4］發現應用 RNA 干擾技術(siRNA)抑制gelectin-3表達后，人類子宮內膜上皮細胞株RL95-2細胞G1期上升，S期下降;整聯蛋白β1表達下降;對細胞外纖維黏連蛋白黏附性顯著降低。von Wolff等報道galectin-3在人類分泌期子宮內膜表達最高［5］，提示gelectin-3參與子宮內膜功能和胚胎植入的調節。杜國平等［6］進一步證實gelectin-3 mRNA和蛋白在分泌中期子宮內膜的表達高于增生晚期，提示galectin-3可能參與了生殖過程的調節，與子宮內膜容受性和胚胎的植入有關。

本研究結果顯示，子宮內膜中galectin-3 mRNA和蛋白表達在IVF失敗患者明顯低于妊娠組，可見IVF失敗患者胚胎著床障礙是主要原因之一。

［1］杜國平，張煒，王麗，等.著床窗口期子宮內膜差異表達基因的研究［J］.中華婦產科雜志，2007，42(3):187-191.

［2］Dumic J，Dabelic S，Flogel M.Galectin-3:an open-ended story［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1760(4):616-635.

［3］Ochieng J，Leite-Browning ML，Warfield P.Regulation of cellular adhesion to extracellularmatrix proteins by galectin-3［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，246(3):788-791

［4］雷彩霞，張煒，孫曉煒，等.Galectin-3表達抑制對子宮內膜上皮細胞生長周期和黏附性的影響［J］.復旦學報(醫學版)，2007，34(2):169-175.

［5］von Wolff M，Wang X，Gabius HJ，et al.Galectin fingerprinting in human endometrium and decidua during themenstrual cycle and in early gestation［J］.Mol Hum Reprod，2005，11(3):189-194.

［6］杜國平，張煒，王麗，等.凝集素半乳糖結合蛋白3在人子宮內膜的表達［J］.復旦學報(醫學版)，2006，33(2):143-146.