米托蒽醌和多西紫杉醇聯合用藥對乳腺癌治療的影響

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004)

米托蒽醌是一種廣譜的抗腫瘤類藥物，其抗腫瘤活性高，而且抗瘤譜廣泛。多西紫杉醇是近幾年開發出的抗腫瘤新藥，具有獨特的抗癌作用機制，其抗瘤譜廣。2010年3～8月，本研究采用米托蒽醌聯合多西紫杉醇治療乳腺癌細胞，通過免疫組化、Real-Time PCR和Western blot等技術，檢測相關基因表達情況變化，探討米托蒽醌和多西紫杉醇聯合作用對乳腺癌治療的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 高糖DMEM培養基購自Thermo Fisher公司，MCF-7細胞購自上海細胞庫。米托蒽醌(Mitoxantrone)杭州民生藥廠，多西紫杉醇購自羅納普朗克樂安制藥有限公司，總RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒2×Taq Real Master-Mix(SYBR Green)均購自天根生物科技(北京)有限公司，引物合成由上海生工公司完成，增殖細胞核抗原(PCNA)和Ki67單克隆抗體購于Abcam公司，免疫組化S-P試劑盒購自武漢博士德公司，其他為國產分析純。

1.2 細胞培養 MCF-7細胞培養于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養，細胞貼壁生長。每2～3 d傳代1次，實驗均選用對數生長期細胞。

1.3 模型建立及分組 建立裸鼠皮下移植瘤模型，取對數生長期MCF-7細胞，細胞濃度為5×106個細胞/m l，分別接種于裸鼠右前肢腋下部皮下接種。裸鼠在SPF條件下飼養，室溫21～25℃，相對濕度60% ～70%，皮膚消毒后將細胞懸液接種于裸鼠右腋皮下，每只注射0.2 ml細胞。36只造模成功裸鼠隨機分為4組，A組為對照組:生理鹽水1 ml/100 g腹腔注射;B組為米托蒽醌治療組:注射米托蒽醌20 mg/kg;C組為多西紫杉醇治療組:腹腔注射多西紫杉醇30 mg/kg;D組為米托蒽醌聯合多西紫杉醇治療組:腹腔注射米托蒽醌20 mg/kg和多西紫杉醇30 mg/kg。治療3周后處死所有裸鼠，剖腹取瘤組織。

1.4 抑瘤率實驗 完整剝離腫瘤，電子天平稱重，稱取瘤質量，計算腫瘤抑制率。瘤組織迅速經甲醛固定，常規石蠟包埋切片。

1.5 PCNA及Ki67蛋白檢測 應用免疫組化S-P法，按照試劑盒使用說明書檢測組織中PCNA及Ki67蛋白表達，400倍顯微鏡鏡下每例隨機取10個視野，計數PCNA與Ki67的標記指數，按陽性細胞百分率分為:陽性細胞率＜5%為陰性(－)，5%≤陽性細胞率＜40%為1級(+)，40%≤陽性細胞率＜70%為2級(++)，70%≤陽性細胞率為3級(+++)。

1.6 磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)表達檢測Western blot法檢測組織標本中PTEN蛋白的表達，嚴格按說明書進行操作。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，計數資料組間比較采有χ2檢驗。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 腫瘤生長分析 見表1。

表1 各組治療結束時腫瘤質量及其抑瘤率比較

2.2 PCNA及Ki67蛋白表達 PCNA陽性表達位于細胞核，A 組(0～3級:0、5.23%、31.27%、63.50%)無陰性，大多為3級陽性表達，B組(0～3級:0、18.16%、39.71%、42.13%)的陽性表達主要集中在 1、2級，與 C組(0～3級:0、31.14%、30.82%、38.04%)之間無差異，D 組(0 ～3 級:0、45.74%、27.83%、26.43%)的陽性表達主要集中在1級，P＜0.05。Ki67蛋白陽性表達，A 組(0～3級:0、10.75%、28.41%、60.84%)Ki67 蛋白的陽性表達主要集中在3級，而在B組(0～3級:0、13.56%、58.34%、28.10%)和 C 組(0 ～3 級:0、19.75%、45.57%、34.68%)中 Ki67蛋白的陽性表達主要為2 級，D 組(0 ～3 級:8.76%、35.28%、25.52%、30.44%)1 級陽性表達升高，P ＜0.05。

2.3 PTEN蛋白表達 PTEN蛋白的表達量在A、B、C和D組中依次升高，P＜0.05。見圖1。

3 討論

圖1 各組PTEN蛋白表達

米托蒽醌是一種較新型的蒽環類藥物，其抗腫瘤活性相當或略高于阿霉素，其作用機制可能是抑制RNA及DNA合成，直接插入DNA堿基對之間干擾轉錄過程，阻止mRNA的形成而起到抗腫瘤作用，米托蒽醌可與很多常用抗腫瘤藥有協同作用［2］。多西紫杉醇是一種半合成的紫杉類化合物，是一種近年來常用來治療乳腺癌有效的藥物［3］。

本研究采用米托蒽醌、多西紫杉醇單獨用藥和米托蒽醌聯合多西紫杉醇治療乳腺癌成瘤裸鼠，通過免疫組化及Western blot等技術，檢測腫瘤組織中PCNA［4］、Ki67［5］及 PTEN［6］蛋白的表達情況，探討米托蒽醌和多西紫杉醇聯合對乳腺癌治療的作用機制。研究發現，應用米托蒽醌治療后，腫瘤得到一定的治療，多西紫杉醇的治療情況與米托蒽醌的治療情況相似，而米托蒽醌聯合多西紫杉醇聯合用藥較單獨米托蒽醌或多西紫杉醇治療的效果更好，移植瘤的抑瘤率上升，腫瘤組織中PCNA蛋白和Ki67蛋白的陽性表達率下降，PTEN蛋白水平表達上升，其變化情況較為治療組有顯著差異。結果表明，米托蒽醌聯合多西紫杉醇可能通過抑制致癌基因的表達，阻斷腫瘤細胞中的蛋白質合成，抑制腫瘤細胞的增殖和癌癥的發展，為新輔助化療乳腺癌的聯合用藥進一步研究奠定一定的基礎。

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