黃芪皂苷Ⅳ對大鼠腦缺血/再灌注后海馬血管生成的影響

李文媛，王 瑩，李明秋，佟曉杰

（1．牡丹江醫學院解剖教研室，黑龍江牡丹江 157011;2．中國醫科大學解剖教研室，沈陽 110001）

血管生成是指由原已存在的毛細血管通過出芽或內填形成新的毛細血管，促進血管生成被認為是治療缺血性腦損傷富有前景的新策略。血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種高度特異的促內皮細胞生長因子，與VEGF受體結合能促進缺血性腦損傷后血管再生及側支循環的形成，在血管生成中起關鍵作用［1，2］。黃芪皂苷Ⅳ是一種純化小分子皂苷（分子質量為784），作為黃芪的主要活性成分［3］，已被廣泛的應用于缺血性腦血管病的治療。但黃芪皂苷Ⅳ對腦缺血/再灌注損傷中血管生成的影響尚不明確。該研究通過建立大鼠大腦中動脈缺血模型，探討黃芪皂苷Ⅳ對腦缺血損傷血管生成的作用機制，為黃芪皂苷Ⅳ治療腦缺血損傷提供新的實驗依據和理論依據。

1 材料與方法

1．1 動物 雄性 SD大鼠42只，清潔級，體質量280～320 g，購于中國醫科大學實驗動物中心（許可證號:SYXK［遼］2003-0013）。

1．2 藥品和試劑 黃芪皂苷Ⅳ（西安賽邦醫藥），純度98%。尼莫地平注射液（河北醫科大學制藥廠），兔抗大鼠VEGF抗體、兔抗大鼠CD34抗體、免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中山生物試劑公司橋生物公司，抗β-actin抗體購于Santa Cruz公司。

1．3 動物分組 大鼠按體質量分層，隨機分為4組:假手術組（n=6）、模型組（n=12）、尼莫地平對照組（n=12）、黃芪皂苷Ⅳ組（n=12）。

1．4 造模 參照Longa等［4］的線栓改良法復制大鼠左側大腦中動脈缺血局灶性腦缺血模型，大鼠用10%水合氯醛（250 mg/kg）麻醉后，分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈和翼腭動脈。分離過程中電凝血管小分支以防出血，結扎翼腭動脈，然后在距頸總動脈分叉1 cm處結扎頸外動脈，并于距結扎處近端約0．5 cm處遠心端用電凝器灼斷之。動脈夾夾閉左頸總動脈，在頸外動脈剪一切口，將一長5 cm，直徑0．26 mm的尼龍線經左側頸外動脈主干切口緩慢向頸內動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進18～20 mm感到輕微阻力時，即阻斷大腦中動脈。阻斷2 h后，拔出尼龍線，扎緊動脈殘端，縫合皮下組織和皮膚，完成腦缺血/再灌注損傷模型。假手術組除不插線外，全過程同其他各組。各組于缺血前5 min，缺血后12、24 h給藥，腹腔注射。黃芪皂苷Ⅳ給藥劑量為20 mg/kg，尼莫地平注射液給藥劑量為1 mg/kg，均為臨床等效劑量。假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。術后當日給大鼠飲水，次日開始自由飲食。

1．5 檢測指標

1．5．1 神經行為學評估 動物缺血2 h拔線栓后，按Zea Longa方法［5］進行神經功能缺損評分:0分，無任何神經功能缺失;1分，左前肢不能伸展;2分，向左側行走;3分，向左側轉圈成追尾狀;4分，意識障礙，無自主行走。評分在1～3分之間視為造模成功，否則棄之不用。保證各組每個時間點的動物數目。由一位不了解分組情況的觀察者在灌流后72 h評估記錄神經行為學評分。

1．5．2 免疫組織化學檢測 以水合氯醛麻醉動物，打開胸腔，暴露心臟，于右心耳處剪一小口，同時將一輸液針頭插入左心室，向主動脈方向灌入37℃左右的生理鹽水，直至右心房流出清亮液體，再由左心室灌入4%多聚甲醛磷酸緩沖液約100 mL固定。斷頭取出腦組織，分離出左側缺血大腦半球，4%多聚甲醛再固定4～6 h，20%和30%的蔗糖梯度脫水，OCT（optimuMcutting temperature）包埋劑包埋，置－70℃冰箱保存。實驗時取出行冰凍切片，在視交叉后1～4 mm處冠狀切面切開，在海馬齒狀平面連續冠狀切片，片厚4μm。組織薄片以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）0．01 mol/L 漂洗 2次，0．5%過氧化氫孵育10 min;PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15 min后，滴加稀釋后的一抗VEGF（1∶100）、CD34（1∶100），4℃過夜。滴加生物素標記體，30 min，37℃。滴加過氧化物-鏈霉素卵白素37℃，30 min。3，3-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽顯色液顯色。蘇木精復染，以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析:每個標本取4張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬CA1區隨機選5個視野，用計算機圖像分析系統（HPIAS-1000）對各組陽性細胞進行吸光度（absorbance，A）分析。

1．5．3 CD34陽性判斷及微血管密度（microvascular density，MVD）計數標準 CD34主要表達在血管內皮細胞胞質，胞質染成黃棕色者為陽性，未被染成黃棕色者為陰性。采用Weidner等［5］制訂的方法即確定組織孤立的棕黃色血管內皮細胞或細胞簇代表一條單獨的微血管，在10倍物鏡下挑選微血管分布最高的區域，然后在200倍視野下（0．723 mm2/視野）計數5個視野中被CD34染成棕黃色的血管數目，取其平均值作為MVD。分辨不清或染色模糊的細胞不計入計數結果。

1．5．4 免疫蛋白印跡檢測 檢測VEGF表達提取蛋白后采用二辛可寧酸法定量試劑盒測定蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉至硝酸纖維素膜;封閉緩沖液封閉后，加入一抗（1∶100稀釋）4℃孵育過夜，二抗（1∶2000稀釋）孵育2 h，TBS洗凈后經顯色液顯示15 min，掃描后經Image J圖像分析軟件對印跡區進行灰度分析。

1．6 統計學方法 所得數據采用SPSS 13．0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析F檢驗，多個樣本均數的兩兩比較采用q檢驗。P＜0．05為差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 神經功能評分 假手術組神經功能損害評分值為0，無神經功能損害。黃芪皂苷Ⅳ組神經功能損害評分低于模型組評分（q=4．65，P ＜0．05）和尼莫地平組評分（q=3．11，P＜0．05），差異有統計學意義（表1）。

表1 各組動物缺血/再灌注72 h后海馬VEGF蛋白和MVD表達（±s）

表1 各組動物缺血/再灌注72 h后海馬VEGF蛋白和MVD表達（±s）

注:VEGF，血管內皮細胞生長因子;MVD，微血管密度

組別 神經功能評分 VEGF吸光度值 MVD（個/400倍視野）32．37 ±2．48模型組 3．62±0．65 8．92±4．74 35．69±2．87尼莫地平對照組 2．71±0．32 11．26 ±3．67 36．43±3．45黃芪皂苷Ⅳ組 1．49±0．21 17．83 ±5．19 44．41±3．59 F假手術組00＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 27．796 36．427 21．193 P

2．2 免疫組織化學染色 VEGF蛋白陽性表達位于細胞質和細胞膜，呈棕黃色顆粒（圖1），陰性細胞的細胞質不著色。假手術組海馬CA1區中未見VEGF蛋白表達，模型組VEGF蛋白表達較假手術組顯著增加（q=4．07，P ＜0．05），黃芪皂苷Ⅳ組 VEGF 蛋白表達較模型組（q=3．91，P＜0．05）和尼莫地平對照組（q=3．57，P ＜0．05）顯著增高，兩組比較差異具有統計學意義（表1）。

圖1 缺血/再灌注后海馬免疫組化染色

2．3 MVD檢測 CD34標記后將微血管內皮細胞的細胞質染色呈棕黃色，陰性細胞的細胞質不著色。CD34標記微血管呈棕色管腔（圖1）。模型組MVD較假手術組顯著增加（q=3．77，P ＜0．05），黃芪皂苷Ⅳ組 VEGF蛋白表達較模型組（q=5．11，P ＜0．05）和尼莫地平對照組（q=4．63，P ＜0．05）顯著增高，兩組比較差異具有統計學意義（P＜0．05）（表1）。

2．4 Western blot檢測 假手術組未見VEGF蛋白表達，模型組VEGF蛋白相對表達較假手術組顯著增加（q=3．44，P ＜0．05），黃芪皂苷Ⅳ組 VEGF 蛋白相對表達較模型組 （q=3．61，P＜0．05）和尼莫地平對照組（q=3．63，P ＜0．05）顯著增高，兩組比較差異具有統計學意義（P＜0．05）（圖2）。

圖2 W estern blot檢測各組VEGF蛋白表達（n=4）

3 討論

腦卒中是導致患者死亡的主要原因。其中45．5%～75．9%為腦梗死［6］，尋找對腦梗死有療效的藥物，降低腦血管病的發病率和病死率是目前國內外學者共同關心的課題。海馬對腦缺血最為敏感，即使短暫的腦缺血也可造成錐體細胞延遲性神經元死亡。所以，海馬成為缺血性腦損傷研究的一個典型腦區。

VEGF是一種高度特異的促內皮細胞生長因子。有研究表明［7］，在缺血性腦損傷半暗帶低氧區，激活的低氧誘導因子1α誘導VEGF和其受體過量表達，VEGF與其受體結合后，可促使新血管生成，改善局部血供，并保護內皮細胞不發生程序性死亡，從而減輕缺血性腦損傷［8］。Zhang等［9］的研究顯示，在缺血大鼠腦表面注入人工重組VEGF165能明顯加強缺血性腦損傷后的血管再生，減輕卒中恢復過程中的神經功能障礙。本實驗顯示腦缺血/再灌后72 h后VEGF蛋白表達和MVD較假手術組顯著增加（P＜0．05），提示腦缺血后可誘導VEGF生成，進而促進血管生成，這與以往的研究結果相一致［8］。Jerzy 等［10］認為，腦缺血損傷后MVD增加與患者生存時間呈正相關，因此如何在缺血性腦損傷早期誘導VEGF大量表達，增加新生血管生成為缺血性腦損傷患者的治療提供了線索。

黃芪是一種被廣泛應用于治療缺血性腦血管病的傳統中藥，具有補氣升陽、利水退腫的功效。黃芪皂苷Ⅳ是黃芪的主要活性成分。有研究顯示黃芪皂苷Ⅳ［11，12］具有降壓，調節機體免疫功能，抗炎癥，鎮靜鎮痛，神經保護，降低病毒活性等多種藥理作用。該實驗中，黃芪皂苷Ⅳ組的神經功能恢復明顯優于尼莫地平對照組和模型組，提示黃芪皂苷Ⅳ具有神經保護作用，這為黃芪皂苷Ⅳ治療缺血性腦損傷提供了行為學上的實驗依據。盡管黃芪皂苷Ⅳ在腦缺血損傷條件下能夠發揮多種作用，但在腦缺血損傷時黃芪皂苷Ⅳ對VEGF和血管生成的影響尚不明確。該實驗結果顯示，黃芪皂苷Ⅳ組大鼠海馬CA1區VEGF蛋白表達和MVD均明顯高于模型組和尼莫地平對照組（P＜0．05）。提示在腦缺血/再灌注損傷時，黃芪皂苷Ⅳ能夠上調VEGF蛋白的表達，從而促進新生血管生成，這可能是黃芪皂苷Ⅳ對腦缺血/再灌注損傷起保護作用的分子機制之一。

［1］Kato H，Yoshikawa M，Miyazaki T，et al．The clinical significance and expression ofvascular endothelial growth factor and its receptor in esphgeal carcinma［J］．Anticancer Res，2000，10（10）:19-20．

［2］Ma Y，Qu Y，Fei Z，et al．Vascular endothelial growth factor in cerebral ischemia［J］．JNeurosci Res，2004，14（10）:36-39．

［3］徐孝麟，王尚蘭．黃芪制劑臨床應用進展［J］．現代臨床醫學，2006，32（2）:138-140．

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］．Stroke，1989，20（1）:84-91．

［5］Weidner N，folkman J．Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early stage breast cancer［J］．Nat Cancer Inst，1992，84（24）:1875-1887．

［6］Zhang LF，Yang J，Hong Z，etal．Proportion of different subtypes of stroke in China［J］．Stroke，2003，34（9）:2091-2096．

［7］Chen C，Hu Q，Yan J，et al．Early inhibition of HIF-1alpha with small interfering RNA reduces ischemic-reperfused brain injury in rats［J］．Neurobiol Dis，2009，33（3）:509-517．

［8］Wang YQ，CuiHR，Yang SZ．VEGF enhance cortical newborn neurons and their neurite development in adult rat brain after cerebral ischemia［J］．NeurocheMInt，2009，55（7）:629-636．

［9］Zhang ZG，Zhang L，Tsang W，et al．Correlation of VEGF and angiopoietin expression with disruption of blood-brain barrier and angiogenesis after focal cerebral ischemia［J］．Cerebral Blood Flow Metab，2002，22（4）:379-392．

［10］Jerzy K，Jozef K，Kumar P，et al．Role of angiogenesis in patients with cerebral Ischemic stroke［J］．Stroke，1994，25（9）:1794-1798．

［11］Yin YY，LiWP，Gong HL．Protective effectof astragaloside on focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats［J］．AMJChin Med，2010，38（3）:517-527．

［12］Qu YZ，LiM，Zhao YL．AstragalosideⅣ attenuates cerebral ischemia-reperfusion-induced increase in permeability of the blood-brain barrier in rats［J］．Eur JPharmacol，2009，606（3）:137-141．