煙草MADS-box家族基因保守片段的克隆與序列分析

李元元，楊愛國，王 魯，羅成剛，賈興華，劉貫山，蘇振剛，王元英*

（1.中國農業科學院煙草遺傳改良與生物技術重點開放實驗室，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

MADS-box家族基因是一類編碼轉錄因子的基因，其命名是根據4個最先克隆的家族成員首字母即 MCM1[1]、AG[2]、DEF[3-4]和 SRF[5]。MADS-box家族基因廣泛分布于植物、動物和真菌中，在雙子葉植物擬南芥、金魚草、番茄、油菜、煙草和矮牽牛，以及單子葉植物玉米、小麥、高粱中研究比較多，其在植物生長發育和信號轉導過程中具有重要作用[6]，特別是在顯花植物響應外界溫光環境條件和內源信號變化，調控開花早晚中起到重要作用[7-9]。在擬南芥中，至少有4條主要的途徑來調控成花誘導和開花過程[10]，其中起主要作用的是FLC、FT和SOC1。 CO響應長日照，激活FT和促進SOC1基因表達[11-12]，而FT和SOC1促進開花過程，即所謂的光周期途徑；與此同時，FLC能相應環境溫度變化，春化（低溫）能抑制FLC的表達，而FLC抑制成花促進基因FT和SOC1 的表達[13-16]，所以低溫促進成花，即所謂春化途徑。

煙草的早花對煙葉產量和品質影響很大，并可能與MADS-box家族基因密切相關。到目前為止，從煙草中克隆到的控制開花時間的FLC、SOC1類同源基因很少[17]。本研究利用RT-PCR的方法從低溫敏感型煙草品種NC82莖尖cDNA中克隆了一批煙草MADS-box家族基因保守片段，分屬于不同的MADS-box家族基因亞類，這為克隆控制煙草開花時間的低溫敏感型基因，研究低溫如何影響煙草開花時間的分子機制，以及培育低溫不敏感型煙草新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及地點

普通煙草品種 NC82屬于低溫敏感品種。將NC82種子進行消毒、浸種和催芽，用塑料軟盤播種種植于中國農業科學院煙草研究所溫室，取NC82苗期莖尖用液氮速凍后，保存于-70 ℃ 冰箱中備用。

1.2 莖尖總RNA的提取與檢測

采用TransZol法 （全式金公司）提取RNA：取200 mg 莖尖樣品，加液氮于研缽中將其研磨成粉末， 將粉末狀樣品轉移至2 mL 離心管中；加入1 mL TransZol，用勻漿儀進行勻漿處理，并用移液槍反復吹吸；室溫靜置5 min，加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫孵育3 min，10000 g 4 ℃ 離心15 min； 轉移無色的水相于新的1 mL離心管中，加入0.5 mL 異丙醇，顛倒混勻，室溫沉淀10 min，10000 g 4 ℃ 離心 10 min；去上清， 加入 1 mL 75%乙醇（DEPC處理的蒸餾水配制），劇烈渦旋，7500 g 4 ℃ 離心5 min；棄上清，室溫晾干沉淀，沉淀溶于50～100 μL RNA溶解液（DEPC處理的雙蒸水）中，55～60 ℃ 孵育 10 min，樣品 -70 ℃ 保存以備長期使用。所提取 RNA用紫外分光光度計檢測吸光度值，并在1% 非變性瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.3 cDNA 第一鏈的合成

使用北京全式金公司的 TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行反轉錄合成cDNA第一鏈。其反應體系20 μL，其中 RNA 1 μL（500 mg/L 左右）；Oligo(dT)20Primer(0.1 μg/μL ) 1 μL；2×TS II Reaction Mix 10 μL；TransScript II RT/RI Enzyme Mix 2 μL；用 DEPC 處理除去 RNase的雙蒸水補充反應體系體積至 20 μL。然后輕輕混勻，于 50 ℃ 孵育 30 min，85 ℃ 加熱5 min使TransScript II RT失活。

1.4 RT- PCR

采用宗成文[18]根據多種植物的 MADS-box家族基因的MADS盒保守區設計的3條上游和3條下游簡并引物。

上游引物:

M1: 5' ATGGGRAGRGGDARRGTBCA 3'

M2: 5' ATGGGRAGRGGDARRGTBGA 3'

M3: 5' ATGGGRAGRGGDARRATHGA 3'

下游引物:

M4: 5' ATSARRGCDACYTCDGCRTC 3'

M5: 5' CKYTCNARDATNCKYTCCAT 3'

M6: 5' GAGAAGAYGATSARRGCDAC 3'

其中R：A or G；D：not C；B：not A；H：not G；Y：C or T；K：G or T；S：C or G；N：A、C、G or T 。這3條上游和3條下游引物可以自由組合成9對引物。

RT-PCR反應體系25 μL：第1鏈cDNA模板1 μL，上下游引物各 0.5 μL (10 μmol/L)，dNTP Mixture ( 2.5 mmol/L ) 2 μL，10×TransStartTaq Buffer （含有 Mg2+） 2.5 μL，TransStart Taq Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，用雙蒸水補充體系體積到25 μL。PCR反應條件：首先95 ℃ 預變性5 min； 再進行 35 個循環（95 ℃ 變性 30 s，50 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 20 s )；最后 72 ℃ 保溫 10 min。RT-PCR產物用1.5 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 割膠回收和轉化

RT-PCR擴增效果比較好的引物組合，使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit對其RT-PCR產物進行割膠回收。用 pEASY-T3 Cloning Kit連接回收產物，根據回收產物的濃度，連接體系確定為，回收片段各 4 μL，pEASY-T3 Cloning Vector 1 μL，25℃15 min；將連接產物轉化感受態細胞Trans1-T1（依照全式金公司試劑指南），涂布于氨芐抗性的LB平板培養基，加 IPTG 和 X-gal 試劑進行藍白斑篩選；37 ℃ 培養過夜后挑取白色單菌落，使用通用M13正反向引物鑒定陽性克隆。每個組合挑取 10個陽性克隆，送上海生物工程公司測序，測得的序列按引物組合分別編號。

1.6 序列及系統發育分析

將測序獲得的核酸序列及其推導的蛋白序列在NCBI上進行Blast分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），確認其是否含有MADS-box家族基因保守結構域；然后用DNASTAR軟件將其推測的氨基酸序列與GenBank數據庫中已知的擬南芥等植物的 MADS-box 家族基因蛋白序列用ClustalW法進行多序列比對，并用Phylip3.68軟件包的NJ（Neighbor Joining）算法生成系統發育樹。

2 結 果

2.1 RNA提取

提取的莖尖總 RNA經紫外分光光度計測定，其OD260/OD280值在1.9～2.0，說明所提取的RNA純度良好，濃度在500 mg/L 左右。提取RNA電泳檢測呈現 3條帶 （圖 1），從上到下分別為 28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA，3條帶清晰沒有拖帶，且28S rRNA的亮度約為18S rRNA亮度的兩倍，說明所提取的RNA質量較好，基本無降解。

圖1 NC82莖尖總RNAFig.1 Total RNA isolated from shoot meristem of tobacco variety NC82

2.2 RT-PCR 擴增煙草MADS-box家族基因保守片段

從9對引物組合對煙草莖尖cDNA的RT-PCR擴增產物的電泳檢測結果看，盡管有3對引物組合（M2和M4、M2和M6及M3和M4）的PCR產物中有非特異性條帶被擴增，但均擴增出一條大約150 bp，而且比較清晰的特異條帶（圖 2），與預計的片段大小基本一致。 對M2和M4，M3和M4以及M2和M6引物組合的RT-PCR產物進行割膠、回收、轉化和鑒定，3對引物組合擴增目的片段的克隆陽性率很高（圖3）。

圖2 RT-PCR擴增煙草MADS-box家族基因保守片段Fig.2 Conserved MADS-box family gene fragments of tobacco amplified by RT-PCR.

圖3 M2和M4、M2和M6以及M3和M4引物組合克隆片段的鑒定Fig.3 Identification of amplified clone fragments with M2 and M4, M2 and M6, M3 and M4 prime combinations.

2.3 序列及系統發育分析

克隆片段測序后的序列長度為 122～146 bp，并帶有起始密碼子。在NCBI 上進行Blast分析，發現所獲得的 27個片段中有 16條序列與MADS-box家族基因具有很高的同源性，其推導的蛋白序列具有MADS_MEF2類保守結構域（圖4），利用部分有代表性的 MADS-box家族基因編碼蛋白中的 MADS_MEF2類結構域序列，例如金魚草的DEF (BAI68389.1)，擬南芥的AG(CAA37642.1)、FLC (AAN04056.1)、SVP(NP_179840.2)、AGL20(NP_182090.1)以及 AGL6 (NP_182089.1)進行多序列比對（圖 5），結果發現克隆的片段與擬南芥等MADS-box家族基因保守結構域含有很少的差異位點，其相似性平均能達到76%。多序列比對結果中，除了克隆片段第一位氨基酸為起始翻譯的甲硫氨酸（M）外，還含有15個保守的蛋白位點, 為所有序列所共有，其中7個位點參與蛋白結合DNA功能，5個位點參與蛋白的二聚化（圖 4、圖 5），與植物 MADS-box家族基因編碼蛋白中的 MADS盒所具有的功能相一致[19]，說明克隆得到了煙草MADS-box家族基因的保守結構域片段。

圖4 克隆的MADS-box家族基因保守片段推導氨基酸的結構域Fig.4 Conserved domain of deduced amino acids translated from obtained MADS-box family gene fragments

圖5 克隆的MADS-box家族基因保守片段與部分已知MADS-box家族基因的蛋白序列比對Fig.5 Multi-alignment of obtained MADS-box family gene fragments with other known MADS-box family gene proteins

根據 Becker等（2003）[20]對植物 MADS-box家族基因的分類結果，將獲得的 16條MADS-box家族基因保守片段與擬南芥 MADS-box家族基因構建系統發育樹（圖6），16條MADS-box家族基因保守片段可以劃分到9個不同的MADS-box家族基因亞類，這些亞家族主要與植物花器官發育和開花時間有關。LyE04、LyE02和LyE05聚到FLC亞家族，LyD08和LyE06聚到STMADS11亞家族，LyD07聚到TM3亞家族，LyE01聚到AGL6亞家族，這 4個亞家族基因都具有控制開花時間的功能。LyE09和LyE11聚到AG亞家族，該家族屬于C/D型花器官同源異型基因；LyD10和 LyD11聚到AGL2亞家族，屬于E類基因；LyE10聚到DEF/GLO亞家族，屬于B類基因；LyD12和LyE08聚到AGL15亞家族；LyD09聚到AGL12亞家族。LyE07和相鄰的群都很近，暫時沒有分到具體的某個群，可能屬于煙草特有的一群。

圖6 克隆的MADS-box家族基因保守片段與擬南芥MADS-box家族基因的系統發育樹Fig.6 A phylogenetic tree of Arabidopsis and tobacco MADS-box containing genes

3 討 論

煙草是一種重要的葉用經濟作物，在農業種植生產過程中有早花現象，即煙草植株沒有達到該品種在當地栽培條件下應有的株高和葉片數，便完成營養生長，過早進入生殖生長和提前開花[21]，并且低溫是導致煙草早花的主要環境因素之一。模式植物擬南芥的研究發現，MADS-box家族基因在調節植物開花時間上具有重要功能[19,22-23]，而煙草早花可能與 MADS-box家族基因響應外界溫光環境變化，調控開花密切相關，所以選用低溫敏感型煙草品種NC82開展該類基因的同源克隆。

植物的 FLC、STMADS11、TM3和 AGL6類MADS-box亞家族基因與植物開花時間相關，所以聚到這些亞家族的 MADS-box家族基因保守片段LyE04、LyE02、LyE05、LyD08、LyE06、LyD07和LyE01可能參與了低溫敏感型煙草NC82對環境溫度的成花響應過程。在擬南芥中，FLC基因能感應外界環境并調節內生代謝途徑，是擬南芥中某些生態型感應春化作用的關鍵因子[24]，其能抑制TM3亞家族的SOC1基因。SOC1是CO對長日照反應和FLC對春化低溫反應的下游靶標基因，調節開花時間，因為低溫抑制FLC表達，從而使SOC1表達量增加而促進開花。STMADS11亞家族的SVP是一個成花轉變抑制因子，SVP的突變體表現早花而不伴有其他明顯表型變化[25]，SVP通過與FLC形成復合體來抑制成花和開花[26]；而 AGL24的功能突變使開花延遲，但 AGL24的強表達又促進早花[27]，AGL24可能在 SOC1和花分生組織身份基因LEAFY （LFY）之間，通過誘導LFY的表達而作為一個調節因子。AGL6亞家族基因的原始功能在于控制胚珠發育，但AGL6也能調節開花時間[28]。所以聚到 FLC和 TM3亞家族的克隆片段 E04、LyLyE02、LyE05和LyD07可能與NC82的溫度反應相關，并作為 FLC和 SOC1的同源基因；聚到STMADS11亞家族的LyD08和LyE06可能是SVP的同源基因，或在參與低溫反應的相關基因間起調節作用；而LyE01可能是AGL6亞家族中新產生的具有控制開花時間功能的基因。

LyE09、LyE11、LyD10、LyD11和 LyE10克隆片段聚類到AG （C/D）、AGL2（E）和DEF/GLO（B）類MADS-box亞家族，說明這些克隆片段所代表的基因可能具有花器官身份基因的功能。LyD12和LyE08聚到AGL15亞家族，AGL15亞家族基因主要在胚和種子中表達[29]，但其同樣能夠在擬南芥苗的莖頂端、花以及葉原基中瞬間表達[30]；LyD09聚到 AGL12亞家族，該家族基因主要在根中表達[31]，但其表達也會在花和莖端的某些類型細胞中表達[32]。所以 LyD12、LyE08和 LyD09可能是組織正常發育所表達的基因，不參與低溫反應過程。AtAGL16和AtAGL17屬于AGL17亞家族基因，其主要在根中表達[32-33]，所以與開花時間，花器官身份，莖組織發育相關的基因片段沒有聚到該亞家族。LyE07可能屬于煙草特有的，不能歸類到已有的植物MADS-box家族基因亞類。

4 結 論

NC82在苗期是其低溫敏感期，利用該時期的莖尖總RNA反轉錄成cDNA進行MADS-box家族基因的同源克隆，得到了16條MADS-box家族基因保守片段，序列長度 122～146 bp，其推導的氨基酸序列與已知的 MADS-box家族基因具有很高的同源性，相似性平均能達到76%，并具有保守的MADS_MEF2類結構域，以及15個保守的氨基酸位點，其中 7個參與蛋白與 DNA的相互作用，4個參與蛋白的二聚化。系統發育分析將 16條保守片段歸入擬南芥不同的MADS-box家族基因亞類，其中包括了參與開花時間調節的FLC、STMADS11、TM3和AGL6亞家族，以及與植物花器官發育相關的AG、AGL2和DEF/GLO亞家族。這些與煙草成花相關的保守片段將作為候選基因片段為克隆全長的低溫敏感型MADS-box家族基因奠定基礎。

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