羊肚菌發酵煙草多糖及其在卷煙中的初步應用

李 仙，董 偉，段繼銘，彭國崗，王定偉

[1.云南瑞升煙草技術（集團）有限公司，昆明 650106；2.紅塔煙草（集團）有限責任公司，云南 玉溪 653100]

羊肚菌( Morchella conica) 隸屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤菌綱（Discomycetes）、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)[1]。作為珍稀的大型真菌，羊肚菌含有大量的真菌多糖及菌物氨基酸，具有獨特的風味，是世界上最著名的食藥兩用菌之一[2]。但是由于資源局限問題，很難在煙用香精香料中大規模使用。本研究從生物技術角度，分離出羊肚菌的菌絲體，利用菌絲體的延展性和羊肚菌代謝纖維素、木質素的生物學特性，首次將其在煙葉水提后的碎片上培養成功，將煙葉中的纖維素、木質素等不可提取的骨架基質轉化為多糖等成分。并以發酵固嵺為香料提取的原料，采用真菌多糖的乙醇沉淀分離工藝獲得具有含量較高真菌多糖的提取物[3]。并對羊肚菌發酵多糖進行了致香成分分析、熱烈解分析及在卷煙中的應用研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種以云南野生黑脈羊肚菌子實體及菌柄等部位為原料采用大型真菌菌絲分離的試管法[4]，經3次傳代后獲得羊肚菌菌絲體，斜面形態見圖 1。煙葉、煙碎片及煙末由車間提供。

儀器為高壓蒸汽滅菌鍋（上海華線醫用核子儀器有限公司）、SKY-211B恒溫搖床（上海素坤儀器有限公司）及生化試劑（北京奧博星生物技術有限公司）。

圖1 野生羊肚菌斜面菌絲形態Fig.1 The mycelium of wild Morchella esculenta（L.）Pers.

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌發酵原料的選擇 羊肚菌是低溫高濕嗜好的大型真菌，具有代謝木質素、纖維素的能力，選用富含纖維素、木質素的煙葉、煙葉碎片、煙末及其水提處理煙渣為原料進行試用固體培養基的配制（水:固料=3:2），121 ℃，滅菌30 min后接種羊肚菌菌絲進行發酵原料的篩選。

1.2.2 發酵用種子的培養 羊肚菌固體發酵用種子培養采用兩種方式：液體搖瓶培養和固體菌棒培養。液體培養基采用文獻[5]提供的培養基配方1（蔗糖2%、酵母膏0.5%、KH2PO40.05%、MgSO40.05%，pH 5.5）；實驗室篩選的最適液體培養基配方2[玉米汁2%、酵母膏2% 、MgSO40.05%、KH2PO40.1%、(NH4)2SO40.5%，pH 7]及固體培養基（采用煙葉碎片水提渣，配制方法同 1.2.1），3種培養基進行種子培養5 d后接種煙葉碎片水提渣，7 d后進行發酵程度的對比。

1.2.3 羊肚菌發酵多糖樣品的制備 以適合菌絲生長的煙葉碎片水提渣進行羊肚菌固體發酵實驗。條件：接種量5%、溫度22 ℃，濕度60%～70%，時間9 d。發酵后固嵺加入2倍水，采用多糖較適溶出溫度90～95 ℃，回流提取2 h，提取2次，合并水提液。濃縮后采用4倍95%乙醇沉淀多糖類物質，離心得多糖成分，65 ℃干燥2 h，呈淺黃色固體粉末即為羊肚菌發酵多糖，溶解后呈棕紅色。

1.2.4 羊肚菌發酵多糖中糖類的分析 羊肚菌發酵多糖中單糖及雙糖測定采用高效液相色譜分析，分析條件：HPLC：waters 2690，檢測器：waters 2410示差檢測器，色譜柱：waters carbohydrate cartridge（4.6×250 mm cartridge）。檢測結果表明，羊肚菌發酵多糖中不含葡萄糖、果糖、麥芽糖及蔗糖，其含糖類型為真菌多糖。

羊肚菌發酵多糖的測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖進行標準曲線制作[6]。準確稱取羊肚菌發酵多糖0.095 g定容100 mL后稀釋20倍，同標準曲線測定OD490 nm。

1.2.5 羊肚菌發酵多糖揮發性成分分析 取羊肚菌發酵多糖10.0 g同時蒸餾萃取后進行GC/MS分析，總離子流圖見圖2，分析結果采用面積歸一法。化合物定性分析是根據GC-MS 聯用所得質譜信息經計算機用Wiley、NISt 98 譜庫與標準譜圖對照、解析，確認其中的化學成分。

圖2 羊肚菌發酵多糖致香成分總離子流圖Fig.2 Total ion current of the polysaccharide extract

1.2.6 羊肚菌發酵多糖熱裂解分析 稱取4 mg羊肚菌煙草發酵多糖放入熱裂解儀中，分別在 300、600、900 ℃時進行熱裂解，裂解產物進入GC/MS進行分離和鑒定，應用Wiley、NISt 98 譜庫進行檢索。

1.2.7 羊肚菌發酵多糖的煙用效果評價 將羊肚菌發酵多糖添加至 1#、2#云南某品牌卷煙加料絲中，添加量0.002%，置于22 ℃和RH60%恒溫恒濕箱平衡水分24 h后卷制成卷煙進行評吸。

2 結 果

2.1 羊肚菌發酵煙葉原料的選擇

以煙葉、煙碎片、煙末及相應水提后煙渣為主要篩選對象，經過羊肚菌固體渥堆發酵后結果如表1。結果表明，由于煙葉本身具有部分煙堿抑制了羊肚菌菌絲的生長，未提取的3種形式的煙葉原料均不適合羊肚菌發酵，而水提后的原料以煙葉碎片為最佳，發酵原料碎片間有合適的間隙，具有較好的通氣性，利于菌絲蔓延。

2.2 種子發酵方法的選擇

采用兩種液體發酵培養基和一種固體發酵培養基進行接種對比后結果如表 2，結果表明，固體菌棒培養的種子具有接種點多，生長速度較快的優點，可以作為固體發酵接種的種子來源。

表1 羊肚菌發酵原料篩選結果Table1 Screening results of tobacco matrix suitable for the growth of Morchella esculenta（L.）Pers.

表2 羊肚菌發酵用種子篩選結果Table2 Screening results of vaccination methods

2.3 真菌多糖含量的測定

通過苯酚-硫酸法測定以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.0127x-0.0073（R2=0.9939），如圖 3。

圖3 葡萄糖標準曲線Fig.3 Glucose standard curve

實驗結果表明，在濃度為 5.52～23.92 μg/mL范圍內吸光值與多糖含量呈良好的線性關系。按要求將樣品稀釋至測定范圍，結果表明，發酵煙草多糖0.095 g定容100 mL后稀釋20倍，同上標準曲線的測定，吸光度為 OD490 nm=0.281，計算真菌多糖含糖量為42.6%。

2.4 羊肚菌發酵多糖揮發性成分分析

羊肚菌發酵多糖主要成分是真菌多糖類物質，略有羊肚菌的天然菌香，GC/MS技術分析后共鑒定出匹配度在80以上的化合物13個，檢測結果顯示主要為長鏈碳酸及其酯類。檢測總離子流圖見圖2，結果見表3。

2.5 羊肚菌發酵多糖熱裂解分析

羊肚菌發酵多糖熱裂解分析結果見表4。結果表明，羊肚菌發酵多糖在300 ℃熱裂解產物較少，均為酮類及醛類物質，在600 ℃及900 ℃熱裂解產物較多，主要產物除糠醛類物質外，還有多種呋喃類和醛酮類成分，這與羊肚菌發酵多糖中高含量的真菌多糖類物質相吻合，裂解主要成分具有甜香、煙草香等香味特征，理論上具有改善卷煙的吸味、豐滿煙香等功能。

表3 羊肚菌發酵多糖主要香氣成分分析Table3 The compositional analysis results of the polysaccharide extract

2.6 羊肚菌發酵多糖在卷煙中的應用效果評價

羊肚菌發酵多糖添加至1#、2#云南某品牌卷煙加料絲中，評價結果見表 5。結果表明，羊肚菌發酵多糖在醇和煙香，提高舒適性，去除雜氣等方面具有明顯效果。

3 結 論

3.1 羊肚菌在煙葉基質上的生長特性

野生羊肚菌分離得到的菌絲對煙草中的煙堿呈現不耐受的特點，通過本研究表明，羊肚菌對煙葉基質要求分散度較好，具有合適的溶氧空隙。通過水提后的煙葉碎片在羊肚菌的適宜生長條件下（溫度22℃，濕度60%～70%），能夠獲得較大的生長量，且蔓延度好，菌絲保持較高的白度，可以作為羊肚菌固體渥堆發酵的基質使用。

3.2 羊肚菌發酵多糖成分的研究

羊肚菌多糖（MEP）有別于煙草多糖成分如纖維素、半纖維素、果膠等成分，相反羊肚菌可以以該類分為底物生成由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等殘基為重復單元組成的雜多糖[7]，根據真菌多糖不溶于乙醇的特點，對真菌多糖進行粗提，其中真菌多糖含量達到42.6%，香氣分析表明，致香成分含量較少，僅檢測出 13種，大部分為長鏈碳酸及其酯類，但通過熱裂解表明，羊肚菌發酵多糖可在抽吸時形成糠醛類物質外，還有多種呋喃類和醛酮類香氣成分，對豐富煙香、改善吸味具有較好效果。

表4 羊肚菌發酵多糖熱裂解成分分析Table4 The pyrolysis results of the polysaccharide extract

表5 羊肚菌發酵多糖在卷煙中的試用效果Table5 The evaluation of cased cigarettes and flue-cured tobacco of the polysaccharide extract

3.3 羊肚菌發酵多糖的應用效果

羊肚菌發酵多糖在卷煙中的試用結果表明，其在醇和煙香、提高舒適性、去除雜氣等方面具有較好的作用，且用量遠遠低于普通香精香料的用量，可適用于卷煙加料及煙葉醇化。

[1]蘭進，曹文苓，徐錦堂.中國羊肚菌屬真菌資源[J].資源科學，1999，21（2）：56-61.

[2]Duncan C J, Pugh N, Pasco D S, et a1.Isolation of a galactomannan that enhances macrophage activation from the edible fungus Morchella esculenta[J].J Agric Food Chem, 2002, 50(20): 5683-5685.

[3]許周善，周曉燕.冬蟲夏草多糖的研究進展[J].工業微生物，2000，30（1）：56-57.

[4]李林輝.野外分離大型真菌菌種技術[J].中國食用菌，2002，21（5）：11-12.

[5]武秋立，安家彥.羊肚菌的液體深層培養[J].食品與發酵工業，2004，30（2）：72-76.

[6]譚曉虹，王治寶，李如章.北五味子中多糖含量的測定[J].河北北方學院學報：醫學版， 2005，22（6）：45-46.

[7]魏蕓，張天佑.羊肚菌多糖的分離純化及組成結構分析[J].植物資源與環境學報，2000，9（2）：14-17.