HPGPC法檢測注射用益氣復脈(凍干)中的糖苷類大分子物質

韓曉萍， 葉正良， 王薇丹， 李德坤， 周大錚， 林瑞超， 劉麗芳

(1.青海省藥品檢驗所，青海西寧 810000;2.天津天士力之驕藥業有限公司，天津 300402;3.中國藥品生物制品檢定所，北京 100150;4.中國藥科大學，江蘇 南京 211198)

中藥制劑化學成分復雜，種類繁多，本身又多為大分子物質，這些大分子如蛋白質、多肽、糖、鞣質、果膠等既有免疫原性，又具有免疫反應性，因此具有致敏的可能性［1］。中藥注射劑直接作用于靜脈，起效快，但是一旦有副作用，就會產生嚴重的后果［2］。2009年7月，國家食品藥品監督管理局出臺了《中藥注射劑安全性再評價質量控制要點》，明確要求對于具體品種的工藝條件下可能存在、而質量研究中未檢出的大類成分，應建立排除性檢查方法，必要時，應建立高分子量物質檢查項。注射用益氣復脈(凍干)是在傳統古方生脈散的基礎上研制而成的新型中藥制劑，由紅參、麥冬和五味子組方而成，具有益氣生津、斂陰止汗的功效。本研究正是基于這一要求展開，建立了一種簡便快捷的方法檢測注射用益氣復脈(凍干)中的大分子物質。確保制劑的安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，G1310A單元泵，G1322A在線脫氣機，G1313A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1362A示差檢測器，Mettle Toledo XS105電子天平。

1.2 試藥 右旋糖苷對照品(Dextran Standard，相對分子質量分別為 180，2 500，4 600，7 100，10 000，21 400，41 100，84 400，133 800。中國藥品生物制品檢定所，批號2000-01)。水為重蒸水，氯化鈉為分析純。注射用益氣復脈(凍干)5批(批號分別為20080201、20080402、20080702、20090204、20090302、天津天士力之驕藥業有限公司提供)，氯化鈉注射液(批號:9G71C，中國大冢制藥有限公司，市售)。

2 方法與結果［3］

2.1 色譜條件 色譜柱為 Ultrahydrogel 250(7.8 mm×300 mm);流動相0.1 mol/L氯化鈉溶液;體積流量0.3 mL/min;柱溫30℃;示差折光檢測器40℃。進樣量20 μL。

2.2 專屬性和線性考察 精密稱取上述9份對照品用氯化鈉注射液配制成各約1 mg/mL的溶液，同時取氯化鈉注射液作空白對照溶液，分別進樣，按上述條件測試，圖譜見圖1。以保留時間tR為橫坐標，右旋糖酐分子質量的lgMW為縱坐標［4］進行回歸處理，得線性回歸方程為:lgMW= －0.208 6tR+8.918，r=0.991，測定結果見表1。

圖1 9種不同分子質量右旋糖酐對照品及空白對照的液相圖譜Fig.1 Chromatogram of nine molecular weight dextrans and background

表1 9種不同分子量右旋糖酐對照品的保留時間Tab.1 tRof nine molecular weight dextrans

結果表明:空白對照溶液在相應的保留時間處均無干擾，右旋糖苷標準溶液在相對分子質量180～133 800范圍內相對分子質量與保留時間呈良好的線性關系。

2.3 精密度考察 精密稱量相對分子質量為4 600和10 000的右旋糖酐對照品，分別用氯化鈉注射液溶解定容，得濃度為1.96 mg/mL和2.07 mg/mL的溶液，分別連續進樣6次，測定保留時間，計算RSD，結果相對分子質量為4 600的右旋糖酐保留時間的RSD為0.83%，相對分子質量為10 000的RSD為1.06%。表明此方法的精密度良好。

2.4 最低檢出限 取上述配制的右旋糖苷4 600和1 000對照品溶液，分別稀釋至10倍、120倍、200倍、400倍、500倍，進樣分析，色譜圖見圖2。

圖2 不同濃度2種右旋糖苷最低檢測限對照品色譜圖Fig.2 The limit of detection of two dextrans

結果表明，二者在稀釋到500倍時，樣品峰消失，故可判斷右旋糖苷對照品的最低檢出限為約4 μg/mL。

2.5 穩定性考察 取上述兩種右旋糖酐對照品溶液，分別放置0、2、4、8 h后按上述條件進樣測定，計算保留時間的RSD，結果相對分子質量為4 600的右旋糖酐保留時間的RSD為0.57%，相對分子質量為10 000的 RSD為0.72%，表明此方法的穩定性良好。

2.6 樣品測定 分別取5批注射用益氣復脈(凍干)用氯化鈉注射液配制成濃度約為1.0 mg/mL的溶液，微孔濾膜濾過，20 μL進樣測定。樣品色譜圖見圖3。

圖3 5批注射用益氣復脈(凍干)的測定色譜圖Fig.3 Chromatogram of five batches of injection(freeze-drying)

結果表明所測5批注射用益氣復脈(凍干)樣品的出峰時間均高于30 min，可判斷樣品中無大分子物質或含量極低。

2.7 樣品穩定性考察 精密稱取批號為20080201注射用益氣復脈(凍干)，用氯化鈉注射液溶解并定容至 0.65 mg/mL。分別考察在 0、2、4、8 h 放置后樣品在注射用氯化鈉注射液中的穩定性。所測液相圖譜見圖4。

圖4 樣品在輔助注射液中的穩定性Fig.4 Stability of sample in auxiliary injection

結果表明:樣品溶解于氯化鈉注射液中后在8 h內測定沒有出現大分子物質，樣品在此輔助注射溶劑中穩定性良好。

2.8 結果 依據凝膠色譜的分離原理:相同實驗條件下，物質的分子質量越大，保留時間越短;分子質量越小，保留時間越長［5］。示差折光檢測器是高度穩定和靈敏的液相色譜和凝膠滲透色譜檢測器，可用于檢測在紫外光范圍內吸光度不高的化合物，如聚合物、糖、有機酸和甘油三酸酯［6］。示差折光檢測器的偏轉式設計，能夠對那些具有低噪音和位移特性的化合物進行靈敏的檢測。從HPLC圖譜中可知所測5批注射用益氣復脈(凍干)樣品出峰時間高于30 min，可判斷注射用益氣復脈(凍干)中無大分子物質或含量極低。

3 分析與討論

3.1 對于中藥注射劑中的大分子物質的排除性檢測方法的確立，目前尚無法規性的方法可參照，本研究中的方法學驗證以《中國藥典》2010版一部附錄ⅩⅧ中藥質量標準分析方法驗證指導原則為基礎。

3.2 中藥注射劑致機體過敏物質很多，一般分為完全抗原和半抗原兩種，完全抗原多為大分子物質，相對分子質量大于10 000，如動物蛋白、多肽等，進入人體內能直接使人體致敏;半抗原為小分子化學物質，而大多數中藥為低分子質量化合物，進入人體后必須先與某些大分子物質如蛋白質等作為載體相結合，才能形成半抗原-載體復合物，引起機體對該種藥物的特異性免疫反應［7-9］。故本研究中選擇相對分子質量為5 000(實際為4 600)和10 000的兩個右旋糖酐對照品做方法學驗證。

3.3 因為是大分子物質的排除性檢測，故在本研究中對精密度、最低檢測限和穩定性的考察均用對照品的相應測定表示。

3.4 注射用益氣復脈(凍干)在臨床使用時規定用氯化鈉注射液做輔助注射劑，故本研究中選擇用氯化鈉注射液做相應溶劑和空白對照。

3.5 分別比較了0.1 mol/L氯化鈉溶液、0.7%硫酸鈉溶液、0.1%疊氮化鈉作流動相之后，在以氯化鈉注射液做溶劑時0.1 mol/L氯化鈉溶液做流動相效果更好［4，10］。

3.6 本研究附帶考察了樣品在輔助注射劑中溶解之后的穩定性，以說明樣品在用氯化鈉注射液中溶解后8 h內沒有發生聚凝和沉淀等變化。

［1］陳季強，藥源性疾病基礎與臨床［M］.北京:人民衛生出版社，1997:649.

［2］王 奇，賴世隆，溫澤淮，等.《國家基本藥物目錄》中藥注射劑類藥品不良反應文獻調查分析［J］.中國藥物警戒，2007，4(3):137-141.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版二部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄130-131.

［4］梁蔚陽.HPGPC法測定低分子右旋糖酐氨基酸注射液的右旋糖酐40分子質量和分子質量分布［J］.藥物生物技術，2008，15(3):216-218.

［5］劉國詮，余兆樓.色譜柱技術［M］.北京:化學工業出版社，2001.218-232.

［6］仲宣惟，黃清泉，奚廷斐.多角度激光光散射檢測器和示差折光檢測器聯用測定殼聚糖分子量及分子量分布［J］.藥物分析雜志，2006，26(9):1258-1260.

［7］梁愛華，李春英，郝 然，等.用清醒Beagle犬進行中藥注射液的類過敏試驗方法研究［J］.中國中藥雜志，2010，35(17):2328-2333.

［8］張文霞，鐘希文，曾聰彥.59例生脈注射液不良反應文獻分析［J］.中國藥物警戒，2010，7(1):55-58.

［9］孫 虹.中藥致皮膚不良反應及其原因分析［J］.中華現代皮膚科學，2005，(1):43-47.

［10］萬丹晶，陳妙芬，陳 鋼.右旋糖配鐵注射液峰位相對分子質量和重均相對分子質量的HPGPC測定［J］.藥物分析雜志，2007，27(5):708-710.