小兒和胃利脾顆粒質量標準研究

鄒 禹， 李 卿， 秦 劍

(1.重慶市第九人民醫院，重慶 400700;2.重慶市中藥研究院，重慶 400065)

小兒和胃利脾顆粒是在多年使用的臨床驗方基礎上，經現代工藝制成的中藥復方制劑，本品由雞內金、山藥、三七、黃芪等藥材組成，臨床證實具有開胃健脾功效，用于小兒脾虛胃弱，食欲不振，營養不良，發育遲緩，面色萎黃等癥。本研究用薄層色譜法在同一色譜條件下對制劑中的三七、黃芪進行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定三七中的有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、黃芪中黃芪甲苷，結果準確可靠，可用于該制劑的質量控制與評價控制成分。

1 儀器與試藥

1100高效液相色譜儀(美國惠普公司)，Waters2695液相色譜儀(美國 Waters公司)，Alltech 2000ES型蒸發光散射檢測器(美國奧泰公司)，薄層成像色譜儀(瑞士卡瑪公司);三七皂苷R1對照品(批號:0745-9804)、人參皂苷 Rb1對照品(批號:0703-200118)、人參皂苷Rg1對照品(批號:110704-200318)、黃芪甲苷對照品(批號:0781-9807)，供定量測定用，均由中國藥品生物制品檢定所提供;硅膠G(青島海洋化工廠，薄層層析用);小兒和胃利脾顆粒(本院自制);乙腈為色譜純;水為去離子水;其余試劑均為分析純。

2 三七、黃芪的薄層鑒別

取本品4 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并水飽和正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨試液，水飽和正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗，吸取上述5種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖1。

圖1 三七、黃芪薄層色譜圖1.缺黃芪陰性樣品 2-4.小兒和胃利脾顆粒 5.缺三七陰性樣品6.黃芪甲苷對照品 7.混合對照品 8.三七皂苷R1對照品9.人參皂苷Rb1對照品 10.人參皂苷Rg1對照品Fig.1 TLC of Notoginseng Radix et Rhizoma and Astragali Radix1.negative sample without Astragali Radix 2-4.samples 5.negative sample without Notoginseng Radix et Rhizoma 6.astragaloside IV 7.mixed reference substances 8.notoginsenoside R1 9.ginsenoside Rb1 10.ginsenoside Rg1

3 三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1定量測定

3.1 色譜條件 色譜柱 Phenomenex C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫;體積流量為1.0 mL/min;檢測波長203 nm;柱溫30℃。理論板數按三七皂苷R1峰計算應不低于4 000。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

3.2 供試品溶液的制備 取本品約3 g，精密稱定，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并水飽和正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨試液，水飽和正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇適量使溶解，移置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取續濾液，即得。

3.3 對照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rg1對照品適量，加甲醇制成每1 mL含三七皂苷R10.21 mg、人參皂苷 Rb10.38 mg、人參皂苷 Rg10.35 mg的混合溶液，即得。

3.4 陰性對照樣品溶液的制備 取不含三七的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法制備陰性對照樣品溶液。

3.5 系統適用性試驗 精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液和陰性對照溶液各10 μL，依照上述色譜條件測定。陰性對照溶液在混合對照品相同保留時間位置上未見色譜峰，說明陰性無干擾。見圖2。3.6 線性關系考察 精密吸取對照品溶液2、4、8、16、20 μL，注入液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標，進樣量(μg)為橫坐標，分別得回歸方程。結果見表2。

表2 線性回歸方程 (n=5)Tab.2 Equations of linear regression (n=5)

3.7 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積值，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷 Rg1峰面積的 RSD分別為0.78%、0.85%和 0.90%(n=6)。表明儀器精密度良好。

圖2 高效液相色譜圖A.對照品 B.供試品 C.缺三七陰性供試品 1.三七皂苷R12.人參皂苷Rg13.人參皂苷Rb1Fig.2 HPLC chromatogramsA.reference substance B.sample C.negative sample without Notoginseng Radix et Rhizoma 1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Rb1

3.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、1、4、8、10、12 h 進樣，三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為0.88%、0.97%和0.95%(n=6)。結果表明，供試品溶液在12 h內穩定性良好。

3.9 重復性試驗 精密稱取同一批樣品6份，照供試品溶液制備方法，測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1質量分數RSD分別為1.04%、1.16%和0.97%(n=6)，表明本試驗方法重復性良好。

3.10 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的同批樣品6份，分別精密加入三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品適量，照供試品溶液制備方法，按確定的色譜條件測定，計算回收率，結果見表3。

3.11 樣品測定 稱取供試品3.0 g，精密稱定，制備供試品溶液，按3.1項下色譜條件，測定。結果見表4。

表3 加樣回收率試驗結果 (n=6)Tab.3 Results of revovery test(n=6)

表4 樣品測定結果 (n=3)Tab.4 Results of sample determination (n=3)

4 黃芪甲苷測定

4.1 色譜條件 色譜柱:Waters symmetry C18色譜柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-水(30∶70);體積流量為0.8 mL/min;檢測器蒸發光散射檢測器;漂移管溫度70℃;柱溫30℃。理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于5 000。

4.2 供試品溶液的制備 取本品約5 g，精密稱定，加甲醇40 mL，超聲處理35 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取4次，每次30 mL，合并水飽和正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次60 mL，棄去氨試液，水飽和正丁醇液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，通過D101型大孔樹脂柱(2.5 g，內徑 1 cm)，以水60 mL 洗脫，棄去過柱液及水洗液，再用20%乙醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用60%乙醇50 mL洗脫，收集60%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇適量使溶解，移置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取續濾液，即得。

4.3 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.38 mg的溶液，即得。

4.4 陰性對照樣品溶液的制備 取不含黃芪的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法制備陰性對照樣品溶液。

4.5 系統適用性試驗 精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各10 μL，測定。陰性對照溶液在黃芪甲苷對照品相同保留時間位置上未見色譜峰，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5，說明陰性無干擾。見圖3。

圖3 高效液相色譜圖A.對照品 B.供試品 C.缺黃芪陰性供試品 1.黃芪甲苷Fig.3 HPLC chromatogramsA.reference substance B.sample C.negative sample without Astragali Radix 1.astragaloside IV

4.6 線性關系考察 精密吸取對照品溶液4、8、12、16、20 μL，進樣，以對照品進樣量的對數值為橫坐標、峰面積的對數值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程 lnA=1.570 0lnC+12.263 3，r=0.999 9(n=5)。結果表明黃芪甲苷進樣量在1.52～7.60 μg范圍內的對數值與峰面積的對數值呈良好的線性關系。

4.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積，黃芪甲苷峰面積的RSD為0.92%(n=6)。表明儀器精密度良好。

4.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、1、3、6、8、10 h 進樣，黃芪甲苷峰面積的 RSD 為0.73%(n=6)。表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

4.9 重復性試驗 精密稱取同一批樣品6份，照供試品溶液制備方法，測定，黃芪甲苷含量 RSD為1.02%(n=6)，表明本試驗方法重復性良好。

4.10 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的同批樣品6份，分別精密加入黃芪甲苷對照品適量，照供試品溶液制備方法，按確定的色譜條件測定，計算回收率，結果見表5。

4.11 樣品測定 稱取供試品5 g，精密稱定，制備供試品溶液，按4.1項下色譜條件，測定。結果見表6。

5 討論

本品的薄層色譜鑒別方法系在同一色譜條件下同時鑒別三七、黃芪成分，尚未見文獻報道;本方法均以陰性樣品為對照，結果表明各薄層斑點不受樣品中其他各藥的干擾，專屬性強，簡單易行，可作為本品定性檢測指標。

表5 加樣回收率試驗結果 (n=6)Tab.5 Results of revovery test(n=6)

表6 樣品測定結果 (n=3)Tab.6 Results of sample determination (n=3)

本制劑由三七，黃芪、山藥等藥材提取制成，樣品成分復雜，含皂苷類物質較多，采用高效液相色譜法測定三七中主要成分。對供試品溶液的提取方法進行比較，采用中性氧化鋁吸附法、大孔樹脂吸附法、水飽和正丁醇萃取法、正丁醇萃取法，試驗結果表明，采用水飽和正丁醇萃取法，后用氨試液洗滌，方法操作簡便，定量測定結果準確，重復性好，可用于本制劑中三七的質量控制。

對制劑中黃芪的有效成分黃芪甲苷測定，采用蒸發光散射檢測器檢測，對樣品的前處理進行研究，采用D101型大孔樹脂純化供試品溶液，并用不同濃度乙醇梯度洗脫，供試品純化效果明顯，經方法學研究結果表明，本定量測定方法能夠用于本制劑中黃芪的質量控制，為制定本制劑的質量標準提供了理論依據。

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