木姜葉柯總黃酮的質量控制方法研究

蔣珍藕， 邱宏聰， 韋寶偉， 李 茂， 陸國壽

(廣西中醫藥研究院，廣西南寧 530022)

木姜葉柯總黃酮是木姜葉柯的干燥嫩葉經提取分離純化的有效部位。木姜葉柯為殼斗科柯屬植物Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.［1］的干燥嫩葉，具有清熱解毒，化痰，祛風，降壓的作用，主治濕熱瀉痢，肺熱咳嗽，癰疽瘡瘍，皮膚瘙癢，高血壓［2］;現代研究表明，木姜葉柯中的黃酮類成分具有降血糖，降血壓，降脂及抗過敏，抗炎等作用，尤其根皮苷在糖尿病及其并發癥的防治中具有獨特的效果［3］，木姜葉柯將可能是一種新型的預防和治療糖尿病的新藥材。為了有效地控制木姜葉柯總黃酮的質量，本實驗對木姜葉柯有效部位總黃酮的質量控制方法進行了研究。

1 儀器、試藥與材料

LC－20A高效液相色譜儀、SPD－20A紫外檢測器(日本島津公司)，威瑪通用多媒體色譜數據工作站;UV2550紫外分光光度計(日本島津公司)、B2200S超聲清洗機(上海必能信超聲有限公司)、LIBROR AEL－200電子天平(日本島津公司)。

根皮苷對照品:購買于 SIGMA公司，批號為083K7072，經高效液相色譜歸一化法測定純度在98%以上。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。薄層層析硅膠 G:化學純，批號00081107，青島海洋化工有限公司。

5批木姜葉柯總黃酮由本課題組提取制備，分別編號為 1#、2#、3#、4#、5#，其中 1#～2#為小試樣品、3#～5#為放大驗證試制樣品。用于制備總黃酮的木姜葉柯藥材采自廣西蘋果縣海城鄉榮芳村陸擁屯，經廣西中醫藥研究院中藥資源所覃德海副研究員及饒偉源副研究員鑒定為殼斗科柯屬植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.的干燥嫩葉。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

取本品細粉0.1 g，加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取根皮苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。再取木姜葉柯對照藥材0.5 g，加甲醇10 mL超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。吸取上述三種溶液各2～5 μL，點于同一含0.4%乙酸鈉的以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯－2－丁酮－甲醇－水(10 ∶5 ∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，熱風吹數分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上，有相同顏色的熒光斑點。經多批樣品試驗，可作為木姜葉柯總黃酮的定性鑒別方法。

2.2 根皮苷的測定方法研究

參照文獻［4－5］并經試驗調整，采用高效液相色譜法對木姜葉柯總黃酮中的主要有效成分根皮苷進行測定。

2.2.1 實驗條件的選擇

2.2.1.1 色譜條件:Thermo HYPERSIL ODS－2(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動相:乙腈－0.1% 磷酸(21∶79);檢測波長:280 nm;柱溫:室溫;進樣量為5 μL。理論板數按根皮苷峰計算，應不低于2 000。在上述色譜條件下，供試品中根皮苷與其它雜質達到基線分離，分離度大于1.5，可滿足定量要求。另吸取甲醇溶劑，注入高效液相色譜儀進行空白試驗，結果在根皮苷出峰處不出現色譜峰，表明溶劑對根皮苷測定不產生干擾。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.1.2 對照品溶液的制備:取根皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液的制備:取本品細粉20 mg，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率80 W，頻率50 kHz)10 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 方法學考察及樣品的測定

2.2.2.1 線性關系考察:精密稱取根皮苷對照品10.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取 0.5、1、2、5、10 mL，分別置 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣5 μL測定。以根皮苷對照品進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=2 067 966X－22 031.903 7(r=0.999 9)，線性范圍:0.105 ～2.100 μg。

2.2.2.2 精密度試驗:對同一供試品溶液(1批)，連續測定5次，記錄根皮苷峰面積。結果RSD為1.67%(n=5)。試驗表明，精密度良好。

2.2.2.3 穩定性試驗:對同一供試品溶液(1批)，于0、1、2、4、10、12 h 依法測定，記錄根皮苷峰面積，結果RSD為1.73%(n=6)。試驗表明，在12 h內被測物穩定。

2.2.2.4 重復性試驗:對同一批樣品(1 批)，平行測定6份，計算根皮苷質量分數。結果平均質量分數為 299.40 mg/g，RSD 為 1.96%(n=6)。結果表明，重復性較好。

2.2.2.5 加樣回收率測定:精密稱取根皮苷對照品33.0 mg，置500 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取重復性試驗項下的木姜葉柯總黃酮樣品約10 mg，平行取6份，精密稱定，分別精密加入上述根皮苷對照品溶液50 mL，按上述擬訂的方法提取、測定，計算回收率，結果平均加樣回收率為 98.74%，RSD 為 1.70%(n=6)，符合定量分析的要求，詳見表1。

表1 根皮苷回收率測定結果(n=6)

2.2.2.6 樣品測定:取第3、4、5 批木姜葉柯總黃酮樣品20 mg，各3份，精密稱定，依法制成供試品溶液，依法測定根皮苷。結果見表2。

表2 根皮苷測定結果(n=3)

2.3 總黃酮測定方法研究

2.3.1 實驗條件

2.3.1.1 對照品溶液的制備:取根皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。

2.3.1.2 供試品溶液的制備:取本品細粉20 mg，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率80 W，頻率50 kHz)10 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液0.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.1.3 測定波長的選擇:吸取根皮苷對照品溶液及供試品溶液各適量，以甲醇做空白對照，在紫外分光光度計200～400 nm波長下掃描，結果根皮苷對照品及供試品均在280 nm波長處有最大吸收，故選擇280 nm作為測定波長。

2.3.2 方法學考察及樣品的測定

2.3.2.1 線性關系考察:精密稱取根皮苷對照品13.01 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取 0.5、1、2、5、7 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為對照品溶液，于280 nm處測定吸光度(A值)。以根皮苷濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，A值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=0.0399X－0.0007(r=0.999 9)，線性范圍:2.602 ～ 36.428 μg/mL。

2.3.2.2 精密度試驗:對同一份供試品溶液(2批)，連續測定6次吸光度，結果RSD為0.38%(n=6)。結果表明，精密度良好。

2.3.2.3 穩定性試驗:對同一供試品溶液(2批)，于0、1、2、4、8、12 h 依法測定吸光度，結果 RSD 為0.69%(n=6)。結果表明，在12 h內測定保持穩定。

2.3.2.4 重復性試驗:對同一批樣品(2 批)，平行測定6份樣品的總黃酮，結果平均質量分數為70.67%，RSD 為1.65%(n=6)。結果表明，重復性較好。

2.3.2.5 加樣回收率測定:取重復性試驗項下的木姜葉柯總黃酮樣品約10 mg，平行取6份，精密稱定，分別精密加入根皮苷對照品7 mg，按上述擬訂的方法提取、測定，計算回收率，結果平均回收率為101.49%，RSD 為 1.37%(n=6)，符合定量分析的要求，詳見表3。

表3 回收率測定結果

2.3.2.6 樣品測定:精密稱取 3、4、5 批木姜葉柯總黃酮樣品20 mg，各3份，依法制成供試品溶液，依法測定，計算結果見表4。

表4 總黃酮測定結果(n=3)

3 討論

3.1 供試品溶液提取時間的選擇 分別對超聲10、20、30 min的供試品溶液進行測定，結果隨著時間的增加，總黃酮增加不明顯，說明超聲處理10 min已能將被測成分基本提取完全，同時考慮到實驗效率和成本，故采用超聲處理10 min作為提取時間。

3.2 總黃酮的測定經典的方法是以蘆丁為對照品比色測定［6－8］，為此，本實驗也曾以蘆丁為對照品，通過絡合比色法測定木姜葉柯中總黃酮，但針對性不強，測定結果不理想。這可能是由于蘆丁屬于黃酮醇類化合物(結構為5、7、3′、4′－ 四羥基黃酮 －3 － 蕓香糖苷)，木姜葉柯中黃酮成分主要為二氫查耳酮類化合物，與蘆丁在結構上差異較大，因此蘆丁不適合用于木姜葉柯總黃酮成分測定。之后，本實驗選擇木姜葉柯中主要成分根皮苷為對照品，采用直接紫外測定法測定總黃酮，結果可靠。

3.3 本實驗除了建立薄層色譜定性鑒別外，還采用高效液相色譜法對主要有效成分根皮苷進行測定，同時還采用紫外分光光度法測定總黃酮。因此，本文所建立的質量控制方法能比較全面地、有效地控制木姜葉柯總黃酮質量。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志:22卷［M］.北京:科學出版社，1998:201.

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