地榆提取物中不同類型鞣質的測定

程 悅， 陳嘉升， 陳建萍， 王冬梅*

(1.中山大學藥學院，廣東廣州 510006;2.香港大學中醫(yī)藥學院，香港)

地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalisL.或長葉地榆Sanguisorba officinalisL.var.longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根，主產于東北、內蒙古、山西、陜西、河南、廣西等地。地榆味苦、酸、澀，微寒，歸肝、大腸經，用于治療便血，痔血，血痢，崩漏，水火燙傷，癰腫瘡毒等癥［1］。鞣質類和三萜類化合物是地榆的主要化學成分，鞣質是其發(fā)揮收斂止血作用的物質基礎［2］。

鞣質(Tannins)又稱單寧，是存在于植物體內的一類結構較復雜的多酚類化合物。K Frendenberg于1920年按照鞣質的化學結構特征將其分為可水解鞣質(hydrolysable tannin)和縮合鞣質(condensed tannin)兩大類［3］。可水解鞣質，即沒食子酸酯類多酚，是多元醇與沒食子酸或與沒食子酸有生源關系的酚酸所形成的酯，其分子內具有酯鍵或苷鍵，在稀酸、稀堿或酶的作用下易水解，產生多元醇和小分子類酚酸，根據其水解產物的不同，分為沒食子鞣質(gallotannin)和鞣花鞣質(ellagitannin)兩大類。縮合鞣質，即聚黃烷醇類多酚，是由兒茶素或沒食子酸兒茶素等黃烷－3－醇類化合物以碳－碳鍵聚合而形成的化合物，不被酸所水解，通常三聚體以上才具有鞣質的性質［4］。

地榆中的鞣質類成分量很高，約為17%，從1982 年開始，Nonaka、Tanaka 等［5－9］先后從地榆中分離出沒食子酸、鞣花酸、地榆素 H－1、地榆素 H－2、地榆素 H－3、地榆素 H－6、地榆素 H－11、(± )－兒茶素、(±)－沒食子酸兒茶素、原花青素 B－3、原花青素 C－2、3－0－沒食子酰原花青素 B－3、4，6－O－雙沒食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷、6－O－雙沒食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷Ⅰ、6－O－雙沒食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷Ⅱ、2，3，4，6－O－四沒食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷、2，3，6－O－三沒食子酰－β－D－吡喃葡萄糖苷和3，4，6－O－三沒食子酰－β－D－吡喃葡萄糖苷、1，2，3－O－三沒食子酰－β－D－葡萄糖、1，2，3，6－O－四沒食子酰－β－D－葡萄糖、2，3，4，6－O－四沒食子酰－β－D－葡萄糖、1，2，3，4，6－O－五沒食子酰－β－D－葡萄糖等化合物，夏紅旻、秦國偉等［10－11］分離出 3，3′，4′－三甲氧基鞣花酸和3－O－甲基沒食子酸甲酯。

可水解鞣質和縮合鞣質由于基本組成的不同，藥理作用和療效顯著不同，即使同類型的鞣質，結構上的微小差異也可導致活性的巨大差異，為了富集地榆中不同類型的鞣質類成分進行進一步的藥效物質基礎以及藥理活性研究，本實驗以可水解鞣質和縮合鞣質作為研究對象，分別測定地榆水提物和各萃取部位的鞣質，采用酸解后HPLC分析的方法測定可水解鞣質，用香草醛硫酸法測定縮合鞣質。

1 材料與儀器

1.1 供試材料

地榆干燥藥材，產地廣西，購自香港大學中醫(yī)藥學院臨床教研中心大藥房，經中山大學藥學院生藥學與天然藥化實驗室楊得坡教授鑒定為薔薇科地榆屬植物地榆Sanguisorba officinalisL.的干燥根。

1.2 試劑與儀器

TU－1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，HPLC色譜儀:島津LC－20AB泵、島津SIL－20A自動進樣器、島津SPD－M20A二極管陣列檢測器(日本島津公司)，Ultimate AQ－C18色譜柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm，美國 Welch 公司)，Millipore超純水系統(tǒng)。

鞣花酸、沒食子酸、兒茶素(美國Sigma公司)，色譜純乙腈(美國Sigma公司)，石油醚(沸程60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、硫酸、香草醛為國產分析純試劑。

2 方法與結果

2.1 地榆水提物及各個萃取部位的制備

干燥地榆藥材2.5 kg，粉碎，冷水浸泡過夜后，加入10倍水(V∶M)、加熱至沸后煎煮1 h，抽濾，濾渣重復煎煮提取1次，抽濾，合并兩次提取液，得地榆水提液。

將水提液濃縮至小體積后，除小部分濃縮得水提物約120 g，其余依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對地榆水提液進行萃取，萃取液減壓濃縮至干，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水層留余物，得率如表1所示。因石油醚萃取物的得量很少，且不含鞣質類成分，故不對其進行鞣質的測定。

表1 地榆各萃取部位得率Tab.1 The contents of different extracts from Sanguisorba officinalis L.

2.2 地榆水提物及各萃取部位中可水解鞣質的測定

可水解鞣質分子內的酯鍵或苷鍵在酸熱作用下易水解，產生沒食子酸和鞣花酸，因此，本實驗采用酸解后HPLC分析的方法［12］，通過測定水解后沒食子酸和鞣花酸，來間接反映可水解鞣質的總量。

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸5.22 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾后，為鞣花酸對照品貯備液(208.8 μg/mL);精密稱取沒食子酸對照品5.00 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾后，為沒食子酸對照品貯備液(200 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取地榆水提物5 mg、乙酸乙酯萃取物 2 mg、正丁醇萃取物 3 mg、水層留余物5 mg，置于5 mL棕色小瓶，加入0.5 mL 2.0 mol/L鹽酸溶液，密封，95℃下酸解8 h。結束酸解后，冷卻至室溫，加入甲醇超聲30 min，轉移至5 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件的選擇 以乙腈和0.2%甲酸－水為流動相，乙腈 0 min(5%)－10 min(15%)－25 min(25%)－35 min(30%)－45 min(90%);體積流量 1 mL/min;進樣量 20 μL;檢測波長254 nm。在該色譜條件下，沒食子酸和鞣花酸的保留時間分別為8.81 min和 27.35 min，沒食子酸和鞣花酸與樣品中其他組分分離良好，理論塔板數均大于5 000，結果見圖1。

圖1 沒食子酸、鞣花酸對照品及乙酸乙酯萃取物酸解后HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of gallic acid，ellagic acid and hydrolyzated ethyl acetate extract

2.2.4 可水解鞣質測定的方法學考察

2.2.4.1 標準曲線和線性范圍 精密吸取0.1、0.25、0.5、0.75、1 、1.5、2、3 mL 鞣花酸對照品貯備液于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制濃度為 5.22、10.44、20.88、41.76、62.64、83.52、125.28 μg/mL 的鞣花酸對照品系列溶液;精密吸取 0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2mL沒食子酸貯備液于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制濃度為 5、10、20、30、40、50、60、80 μg/mL的沒食子酸對照品系列溶液。按2.2.3項下色譜條件進行分析，分別以對照品沒食子酸、鞣花酸的濃度X(μg/mL)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標進行回歸分析。

結果顯示，鞣花酸濃度在 5.22 ～125.28 μg/mL范圍內線性良好，回歸方程為:Y=167 410X－463 853，r2=0.998 8;沒食子酸濃度在 5.00 ～80.00 μg/mL范圍內線性良好，回歸方程為:Y=21 461X+23 487，r2=0.999 7。

2.2.4.2 精密度試驗 在2.2.3項下色譜條件，分別將鞣花酸和沒食子酸對照品溶液重復進樣6次，測得鞣花酸和沒食子酸峰面積的RSD分別為0.13%和0.04%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復性試驗 稱取地榆乙酸乙酯萃取物2 mg共6份，按2.2.2項下制備供試液樣品，按2.2.3項下色譜條件進行分析，測得鞣花酸和沒食子酸質量分數均值分別為57.63 mg/g和149.33 mg/g，RSD分別為0.71%和0.98%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 稱取地榆乙酸乙酯萃取物2 mg，按2.2.2項下制備供試液樣品，配制后分別于第0、1、2、4、8、16、24 h 進樣 7 次，按 2.2.3 項下色譜條件進行分析，測得供試品中的鞣花酸和沒食子酸峰面積的RSD分別為0.31% 和0.20%，表明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知量的地榆乙酸乙酯萃取物9份，每份約1.2 mg，分別加入不同量的鞣花酸和沒食子酸對照品溶液，制備3個不同濃度的樣品，每個濃度平行3份，按2.2.2項下制備供試液樣品9份，按2.2.3項下色譜條件進行分析，結果如表2所示，鞣花酸與沒食子酸加樣回收率分別為 100.36% 和 102.77%，RSD值分別為1.45%和1.20%，表明該方法的準確度良好。

2.2.5 地榆水提物及各萃取部位中可水解鞣質的測定 分別稱取地榆水提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物各3份，按照按2.2.2項下制備供試液樣品，按2.2.3項下色譜條件進行分析，測定供試品中沒食子酸和鞣花酸的量，結果如表3所示。

2.3 地榆水提物及各萃取部位中縮合鞣質的測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對照品52.59 mg置于50 mL量瓶中，用甲醇溶劑并稀釋至刻度，搖勻，為對照品貯備液(1.051 8 mg/mL)。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取地榆水提物 5 mg、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物樣品各2 mg，水層留余物50 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇，超聲溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，為供試品溶液。

2.3.3 縮合鞣質測定方法 采用香草醛硫酸法［13］，取供試品溶液0.5 mL，加入包有錫箔的試管中，分別加入2.5 mL 3%香草醛甲醇溶液和2.5 mL 30%濃硫酸甲醇溶液，搖勻，避光顯色20 min后，在500 nm處測定吸光度A500。

表2 加樣回收率試驗(n=9)Tab.2 Results of recovery test(n=9)

表3 地榆水提物及各萃取部位的可水解鞣質測定Tab.3 Contents of hydrolysable tannins in the aqeous extract of Sanguisorba officinalis L and its different solvents partitioned extracts

2.3.4 縮合鞣質測定的方法學考察

2.3.4.1 標準曲線和線性范圍 精密量取兒茶素對照品貯備液 0.5、1、2、3、4、5 mL 分別置于 10 mL量瓶中，分別加入甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，備用。分別取上述各濃度對照品溶液0.5 mL，按2.3.3項下測定，以對照品溶液的濃度(X，mg/mL)為橫坐標，對照品吸光度值A500(Y)為縱坐標，進行回歸分析。結果顯示，兒茶素對照品濃度在0.054 1～0.525 9 mg/mL范圍內線性良好，回歸方程為Y=2.252 3X－0.107 7，r2=0.999 1。

2.3.4.2 精密度試驗 取對照品溶液0.5 mL，按2.3.3項下測定，連續(xù)測定 6次 A500，RSD 為0.20%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 重復性試驗 精密稱取1 mg地榆乙酸乙酯萃取物6份，按2.3.2 項下制備供試液，按 2.3.3項下測定 A500，計算縮合鞣質均值為593.55 mg，RSD為1.70%，表明該方法重復性良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取地榆乙酸乙酯萃取物1 mg，按2.3.2項下制備供試液，同一供試品溶液分別于第 0、1、2、4、8、24 h 按 2.3.3 項下測定A500，共測定6次，RSD為1.32%，表明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗 稱取1 mg已知質量分數的地榆乙酸乙酯萃取物9份，分別加入不同質量分數的兒茶素對照品溶液，制備3個不同濃度的樣品，每個濃度平行3份，按2.3.2項下制備供試液樣品9份，按2.3.3項下測定A500，結果如表4所示，兒茶素的加樣回收率為99.37%，RSD值為1.06%，表明該方法的準確度良好。

2.3.5 地榆水提物及各萃取部位中縮合鞣質的測定 分別稱取地榆水提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物各3份，按照按2.3.2項下制備供試液樣品，按2.2.3項下測定A500，結果如表5所示。

3 討論

3.1 地榆水提物及各個萃取部位鞣質量的差異

由以上結果可知，所含可水解鞣質和縮合鞣質量高低順序均為:乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞水提物＞水層留余物。可水解鞣質和縮合鞣質在乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中量較高，這說明乙酸乙酯和正丁醇萃取均可使兩種類型鞣質類成分得到富集，尤其是沒食子鞣質和縮合鞣質的富集效果顯著，乙酸乙酯萃取物中沒食子鞣質和縮合鞣質的量分別是水提物中量的7.1倍和3.2倍，正丁醇萃取物中沒食子鞣質和縮合鞣質的量分別是水提物中量的4.9倍和2.6倍。

表4 加樣回收率試驗(n=9)Tab.4 Results of recovery test(n=9)

表5 地榆水提物及各萃取部位的縮合鞣質測定Tab.5 Content of condensed tannins in the aqeous extract of Sanguisorba officinalis L and its different solvents partitioned extracts

3.2 地榆不同鞣質測定方法的優(yōu)缺點

可水解鞣質的測定，采用酸解后HPLC分析的方法，其原理是在酸熱作用下，多酚分子內的酯鍵或苷鍵易水解，產生沒食子酸和鞣花酸，用HPLC法可以準確測定多酚水解后生成的酚酸，其優(yōu)點在于準確度高，靈敏度好，不受其他物質的干擾。

縮合鞣質的測定采用香草醛硫酸法，其原理在于酸性條件下黃烷醇類多酚組成單元兒茶素的A環(huán)上的羥基能與香草醛發(fā)生縮合反應，在一定濃度范圍內，該顯色物質在一定的吸收波長處的吸光度與縮合鞣質的濃度成正比，其優(yōu)點在于其線性最好，而且測量值最接近于標準品的真實值［14］，經過顯色反應條件優(yōu)化試驗，最終確定香草醛甲醇溶液濃度為3%，濃硫酸甲醇溶液濃度為30%，避光顯色20 min為反應條件。

2010版中國藥典中的鞣質的測定方法［15］，其原理是多酚結構中的酚羥基能夠還原鎢鉬酸生成藍色化學物質，根據此原理分別測定總酚與不被吸附的多酚量，鞣質量即為總酚與不被吸附多酚的量之差，此法比較穩(wěn)定，重現性好，因而成為測定與蛋白結合鞣質量的經典方法，但此方法并不能區(qū)分可水解鞣質和縮合鞣質。

本試驗采用的酸解后HPLC分析和香草醛硫酸法分別測定兩種不同類型鞣質的量，方法簡便、快速、精密度、穩(wěn)定性、重現性、專屬性好，適合作為中藥或天然藥物中不同類型鞣質的測定方法。

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