粗根蕁麻提取物對環磷酰胺所致小鼠免疫功能低下保護作用的實驗觀察

李仲昆， 尹為民， 王崇靜， 王 珩， 任曉明， 李 靜， 蔣立虹*

(1.昆明市延安醫院，云南昆明 650051;2.云南省第一人民醫院 云南昆明 650032)

蕁麻屬植物在我國已有近千年的藥用歷史，國外從古羅馬時期就開始藥用，德國已經開發出治療風濕、前列腺炎的產品，國外對大蕁麻和異株蕁麻進行了較系統的研究，發現其可以用來治療前列腺增生、風濕性關節炎、過敏性鼻炎、高血壓、心臟病、糖尿病，此外還具有抗病毒及免疫調節活性［1-3］。而我國目前尚無產品。研究論文都停留在抗炎方面，而對免疫調節方面的研究報道很少。本試驗用環磷酰胺制備小鼠免疫功能低下的模型，然后給與口服粗根蕁麻提取物，通過測定小鼠血清溶血素、白細胞介素2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)、T 淋巴亞群 CD3、CD4、CD8 的量，觀察粗根蕁麻的免疫調節作用。現報道如下。

1 材料

1.1 動物

ICR雄性小鼠120只，購自昆明醫學院動物科，合格證號 SCXK(滇)2010-0008，體質量(20 ±2)g。

1.2 藥物及主要試劑

1.2.1 受試物 粗根蕁麻Urtica MacrorrhizaHand-Mazz:采自云南賓川雞足山，由昆明植物所李錫文教授鑒定。

水提物的制備方法:將干燥后的粗根蕁麻粉碎后，經過2次水提取，合并提取液，干燥后即得，一般可以得到10%的干燥品，即1 g相當于10 g生藥。

粗多糖的制備方法:將干燥的水提物25 g，加水70 mL溶解，加95%乙醇350 mL，攪拌，傾去上層液體。沉淀加水50 mL溶解，加95%乙醇250 mL，攪拌，傾去上層液體，沉淀干燥后即得。可得9 g粗多糖，即1 g相當于28 g生藥。

精制多糖的制備方法:將干燥的水提物25 g，加水70 mL溶解，加95%乙醇350 mL，攪拌，傾去上層液體。沉淀加水50 mL溶解，加95%乙醇250 mL，攪拌，傾去上層液體，此操作再重復2次，沉淀干燥后即得。可得6.5 g精制多糖，即1 g相當于38 g生藥。

1.2.2 主要試劑 注射用環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，09080521)。補體:抽取4只豚鼠心臟血，雌雄各半，分離新鮮血清，混合后備用，臨用時生理鹽水稀釋1∶10。雞紅細胞(5%CRBC)，取新鮮雞血，除去纖維蛋白，用生理鹽水制備為5%CRBC懸液備用。IL-2、IFN-γ試劑盒，購于昆明晶美公司。流式試劑 Mouse CD3E PE-CY5，mouse CD4 FITC，mouse CD8-PE，為BD公司試劑。

1.3 主要儀器

紫外分光光度計(日本島津UV-2401-PC)。酶標儀(美國Bio-RAD680)。流式細胞儀(美國BD公司)

2 方法

2.1 粗根蕁麻對免疫低下小鼠血清溶血素的影響

2.1.1 模型制備［4］ICR雄性小鼠60只，隨機分為5組:對照組，模型組，粗根蕁麻A(水提物)、B(粗多糖)、C(精制多糖)組。實驗開始后，粗根蕁麻A、B、C組灌服藥物，共給藥7 d，給藥劑量為0.5 g/kg。對照組、模型組每天灌服水0.3mL。對照組、模型組、粗根蕁麻A、B、C組第1天腹腔注射5%CRBC懸液0.4mL，模型組、粗根蕁麻A、B、C組在第2天腹腔注射環磷酰胺100 mg/kg。第8天按照2.1.2項下進行測定。

2.1.2 溶血素測定 給藥后第8天摘取小鼠眼球取血，注入1.5 mL塑料離心管中，室溫放置1 h，離心分離血清，取血清，用生理鹽水稀釋200倍，取稀釋血清2.0 mL與5%雞紅細胞混懸液1.0 mL，10%補體血清1.0 mL混合，在37℃恒溫箱孵育30 min，0℃冰箱中放置30 min終止反應，離心取上清液，在紫外分光光度計540 nm處，測吸光度OD值。以不加血清的空白對照管上清液作對照比色。

2.2 粗根蕁麻對免疫低下小鼠 IL-2、IFN-γ、CD3、CD4、CD8的影響

2.2.1 模型制備［5-6］ICR 雄性小鼠60只，隨機分為 5組:空白對照組(Control)、模型組(Model)，粗根蕁麻A(水提物)、B(粗多糖)、C(精制多糖)組。實驗開始后，粗根蕁麻A、B、C組灌服藥物，共給藥7 d，給藥劑量為0.5 g/kg。空白對照組、模型組每天灌服水0.3 mL。除空白對照組，其余各組在第2天腹腔注射環磷酰胺100 mg/kg。第8天取血。

2.2.2 測定:取血清按照小鼠酶聯免疫(ELISA)IL-2、IFN-γ試劑盒使用說明操作，測定小鼠血清中IL-2、IFN-γ的水平。肝素抗凝血當天用流式法測定T細胞亞群。

3 結果

3.1 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響

粗根蕁麻A、B、C均可對抗環磷酰胺所致小鼠血清溶血素水平的降低，與模型組比有顯著差異。結果見表1。

3.2 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ的影響

粗根蕁麻A、B、C可增加環磷酰胺小鼠血清IL-2、IFN-γ的水平。與模型組比較有顯著差異。結果見表2。

表1 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠血清溶血素試驗結果

表2 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ的影響

3.3 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠T細胞亞群的影響

模型組的CD3、CD4百分比均明顯低于對照組(P＜0.05)，粗根蕁麻 A、B、C 組的 CD3、CD4百分比均明顯高于模型組(P＜0.05)。模型組與粗根蕁麻A、B、C組比較，CD4/CD8明顯偏低(P＜0.01)。見表3。

表3 粗根蕁麻提取物對小鼠T細胞亞群的影響

4 討論

體液免疫效應是由B細胞通過對抗原的識別、活化、增殖，最后分化成漿細胞并分泌抗體來實現的。血清中溶血素水平的高低是衡量體液免疫的重要指標。［7-9］

本試驗結果表明灌服粗根蕁麻組光密度值與環磷酰胺組相比顯著提高，即血清溶血素水平升高，有顯著差異，從而證明粗根蕁麻對小鼠體液免疫功能具有顯著促進作用。

本研究中，粗根蕁麻組小鼠的IL-2和INF-γ水平顯著高于模型組，說明粗根蕁麻能提高小鼠的免疫防御功能。IL-2可誘導部分B細胞分泌生長因子以及造血因子，還能激活巨噬細胞，最終使免疫效應擴大和增強。INF-γ具有較強的免疫調節功能，能增強細胞功能，加快免疫復合物清除和提高吞噬異物功能，對淋巴細胞具有雙向調節作用。

本研究中，模型組的總T淋巴細胞(CD3)及CD4百分比均明顯低于對照組，說明環磷酰胺對小鼠細胞免疫功能有損傷。粗根蕁麻A、B、C組的總T淋巴細胞(CD3)及CD4百分比均明顯高于模型組，說明粗根蕁麻對受損的小鼠細胞免疫功能有恢復作用。從CD4/CD8分析，模型組與粗根蕁麻A、B、C組比較明顯偏低，提示粗根蕁麻可能通過提高CD4/CD8改善小鼠細胞免疫功能。

由此可見，粗根蕁麻可以用于輔助治療免疫功能低下導致的各種疾病，如過敏性疾病、腫瘤、糖尿病等。

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