人硫氧還蛋白基因真核表達載體的構建及其在COS-7細胞中的表達

蘇 偉 高 楓 龔少愚 魏慧淵 孫茂民 江家貴 (南京中醫藥大學無錫附屬醫院，江蘇 無錫 2400)

硫氧還蛋白(TRX)是一類分布廣泛的小分子多功能蛋白，在細胞內行使著各種不同的功能〔1〕。TRX與其還原酶及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADPH)構成的氧化還原系統介導氫的傳遞，亦可單獨作為蛋白質二硫鍵氧化還原發揮作用，對許多蛋白質的功能進行調節〔2，3〕。TRX有強烈的清除體內過氧化物的功能，在機體抗氧化過程中起著重要的作用〔4，5〕，對防止心腦器官缺血再灌注損傷性有重要作用〔6〕。人TRX(human thioredoxin，hTRX)基因定位于3p12-p11，基因全長13 kb，其保守區為318 bp，開放閱讀框架編碼了含104個氨基酸組成蛋白質〔7，8〕。為探討hTRX基因的生物學活性及其在內皮細胞氧化應激過程中的作用，本文擬克隆并構建hTRX的真核表達載體，為后續研究的開展提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 RNA抽提試劑盒、TaqDNA聚合酶、限制性核酸內切酶 EcoR I、BamH I、dNTPs、MgCl2均購自大連寶生物工程公司。逆轉錄試劑、pcDNA3.0質粒購自上海申能博彩生物科技制品有限公司。DH5α菌株由本室保存，pUCm-T Vector載體試劑盒購自Promega公司。正常人胎肝取自水囊引產之胎兒(4月齡)。中國人民解放軍蘇州100醫院婦產科。hTRX引物P1:5'-CGGAATTCATGGTGAAGCAGATCGAGAGC-3'，P2:5'-CGGGATCCGATTAGACTAATTCATTAATG-3'。上游引物5'端設有DNA限制酶(EcoRⅠ)酶切位點，下游引物:5'端含限制性核酸內切酶Ⅰ(BamHⅠ)酶切位點。引物參考GenBank的hTRX基因序列(J04026)設計，由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR擴增hTRX cDNA ①取胎兒肝組織約150 mg，參照RNA抽提試劑盒手冊進行總RNA的提取。②取3 μl總 RNA，15 mmol/L Oligo(dT)18 加入 2 μl，65℃ 作用5 min;然后加入5×RT緩沖液4μl，10 mmol/L dNTPs 2μl和0.5μl RNA酶抑制劑，1μl逆轉錄酶(M-MLV)逆轉錄酶，最后加雙蒸水至總體積為20μl，置37℃水浴1 h，90℃處理10 min后，獲得cDNA模板。③ 取 cDNA 模板2μl，P11μl，P21μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，10 × Reaction Buffer 5 μl，MgCl23 μl，TaqDNA 聚合酶1 μl，dd H2O 35 μl，擴增體積為 50 μl，置 PCR儀中擴增。首先94℃ 3 min預變性，然后進行下列循環:94℃45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共 32 個循環，最后 72℃ 延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 重組pUCm-T/hTRX質粒的構建與鑒定 將hTRX cDNA與pUCm-T載體進行體外連接(參照Promega公司T載體系統說明書進行)，然后轉化DH5α感受態細菌，用抗性篩選法挑選陽性菌落并進行測序，取測序正確的重組質粒進行擴增。

制備DH5α大腸桿菌感受態細胞并轉化。過程如下:①取活化的DH5α按1%接種入30 ml LB培養基中振蕩培養，至OD值為0.3左右。②倒入50 ml離心管中0℃，10 min。→4℃，5 000 r/min，離心 5 min。→棄上清，振松菌塊，加入 8 ml 100 mmol/L預冷 CaCl2，0℃，30 min。→4℃，5 000 r/min，離心5 min。→棄上清，振松菌塊，加入200μl 100 mmol/L預冷CaCl2。③按下表進行轉化:

表1 質粒轉化及分組

④0℃，30 min。→ 42℃，90 s。→0℃，2 min。→ 加37℃預熱的LB 1 ml。→37℃，45 min搖動震蕩培養。⑤5 000 r/min，離心5 min，棄上清。留100μl混懸液分別涂布平板，37℃置隔水式恒溫培養箱。⑥待實驗組平板有藍白菌落生長時，從中挑取白色單菌落接種于5 ml 1%LB中，37℃，震蕩培養過夜。⑦用V-gene公司質粒抽提試劑盒提取質粒。

1.2.3 hTRX克隆基因序列分析 以陽性克隆重組質粒cDNA為模板，選擇T7測序引物，雙脫氧終止法測定克隆基因序列。

1.2.4 pcDNA3.0/hTRX真核重組質粒的構建 用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切經測序驗證的pUCm-T/hTRX質粒DNA，回收目的hTRX cDNA基因片段，將其定向克隆至經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切的pcDNA3.0真核表達質粒上，以常規氯化鈣法轉化DH5α感受態細胞，用PCR和雙酶切分析法鑒定重組子。雙酶切反應:體系①pMD18-T 10 μl，10 ×Buffer 5 μl，EcoRⅠ 0.9 μl，BamHⅠ 0.7 μl，ddH2O 33.4 μl共 50 μl。②pcDNA3.0 10 μl，10× Buffer 5 μl，EcoR Ⅰ 1.0 μl，BamH Ⅰ 0.8 μl，ddH2O 31.2μl，共50μl。在37℃作用3～5 h，隨后進行核酸瓊脂糖電泳，用V-Gene公司膠回收試劑盒分別回收hTRX cDNA片段和pcDNA3.0載體分別經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后用于連接反應。基因重組連接反應體系:hTRX cDNA片段3μl，雙酶切的pcDNA3.0 1.5 μl，10 × Buffer 1 μl，T4 DNA 連接酶 0.8 μl，ddH2O 3.7 μl，共10 μl，16℃ ～18℃連接過夜，以備轉化。后續的轉化、酶切及PCR鑒定方法同hTRX克隆載體部分相同。

1.2.5 pcDNA3.0-hTRX轉染非州青猴腎細胞(COS-7)細胞

接種COS-7細胞于6孔板，3×106個細胞/孔，37℃，5%CO2條件下孵育18～24 h至60% ～80%融合度，然后用無血清DMEM將上述貼壁COS-7細胞洗1～2次，加入預先混合30 min的溶液 A:pcDNA3-ING4 6 μl、DMEM 94 μl;B:Lipofectamine 8 μl、DMEM 92 μl。于37℃、5%CO2條件下孵育5 h，補加1 ml DMEM含20%胎牛血清(FCS)/孔，繼續孵育18～24 h，換液為DMEM(10%FCS)，37℃，5%CO2條件下繼續培養24～72 h后收集COS-7細胞(4℃保存備用)，同時以同樣的方法將pcDNA3.0空載體轉染的COS-7細胞作空白對照。

1.2.6 COS-7細胞中hTRX mRNA的檢測 轉染72 h后，分別收集實驗組hTRX基因重組質粒和空載體質粒轉染的COS-7細胞，Trizol提取細胞總RNA，以此RNA為模板按常規法合成cDNA第一鏈，用上述引物的常規PCR法擴增hTRX編碼區cDNA。具體反應條件為 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，熱循環32次，最后72℃延伸10 min。產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2 結果

2.1 PCR擴增hTRX基因 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示為一約335 bp的片段，與理論預測結果相符。見圖1。

圖1 RT-PCR擴增產物凝膠電泳分析

2.2 重組質粒pUCm-T/hTRX的鑒定 pUCm-T/hTRX質粒經PCR和雙酶(EcoRⅠ、BamHⅠ)切法鑒定均出現335 bp大小的條帶，表明重組載體構建正確。見圖2。

2.3 擴增hTRX基因測序與分析 測序結果與已發表的序列和基因庫數據相比完全一致。

2.4 重組真核表達載體pcDNA3.0/hTRX的鑒定 pcDNA3.0/hTRX經PCR和雙酶切(EcoRⅠ、BamHⅠ)鑒定均出現了335 bp大小的條帶，測序結果同克隆測序結果，表明真核表達載體構建正確。見圖3。

圖2 重組質粒的PCR及酶切鑒定

2.5 hTRX基因在轉染COS-7細胞中的表達檢測 經RT-PCR檢測證實hTRX基因轉染細胞內有hTRX mRNA表達，而轉染空白載體pcDNA3.0的細胞內無hTRX mRNA表達。見圖4。

圖3 重組真核表達載體的PCR及酶切鑒定

圖4 RT-PCR鑒定hTRX mRNA

3 討論

Wollman等首次從3B6EB病毒轉化的人淋巴母細胞B細胞(3B6 Human EBV Lymphoblastoid B Cell Line)克隆hTRX基因全長cDNA序列。Kaghad等從λEMBL4嗜菌體人類基因文庫中分離出hTRX全長cDNA片段。hTRX基因長達13 kb并含有5個外顯子被4個內含子分開，編碼12 kD的蛋白質。Southern分析表明在人類基因組中存在幾種hTRX基因，但至少其中之一是無活性的假基因〔7〕。同植物和細菌的 TRX一樣，hTRX具有高度保守的酶活性中心:Trp-Cys-Gly-Pro-Cys。活性中心的二巰基可被可逆的氧化形成二硫鍵，并可通過這個過程來控制靶蛋白中二硫鍵或二巰基的形成，調控靶蛋白的活性與功能。研究發現，其活性部位CXXC存在于許多具有類似活性的蛋白質中〔8，9〕，但是，hTRX與大腸桿菌TRX的活性中心不同，其活性中心還有另外的三個半胱氨酸，該結構賦予hTRX獨特的生物活性。已證實成人T白血病細胞的自分泌生長因子——成人T細胞衍生因子(ADF)即為hTRX。

因為mRNA編碼hTRX在細胞分裂活躍的組織中高表達，所以，以胎肝細胞RNA為模板，根據hTRX基因已知序列設計引物，用RT-PCR方法擴增出hTRX成熟蛋白基因片段。經克隆后測序分析比較，結果與Gasdaska等從HT 29結腸癌肉瘤細胞、Lalop EB病毒轉換化的人淋巴母細胞(Lalop Human EBV Lymphoblastoid Cell Line)和正常人肝組織提取的hTRX cDNA序列完全相同。克隆序列與Genbank提供的hTRX cDNA序列完全相同。王應等通過對從人胚肝細胞來源的hTRX c DNA序列分析，發現其只包含了hTRX的第1，2，4，5個外顯子，第3個外顯子(60 bp)被完整地剪切掉，其他核酸序列及另外六種模板來源的hTRX cDNA序列與Genbank提供的相同〔10〕。編碼hTRX成熟蛋白的cDNA基因的克隆成功，為進一步研究其功能活性提供了條件。

真核表達載體是基因轉導的理想載體，陽離子脂質體介導法又以其轉染效率高、無免疫原性、整合和擴散性小、操作簡便、容量大而受到國內外學者關注。本實驗中構建了hTRX真核表達載體，經PCR、雙酶切和基因測序結果均表明重組載體pcDNA3.0/hTRX構建正確，為進一步研究hTRX基礎。

作為一種真核瞬時表達系統，COS-7細胞是研究蛋白質結構與功能的有利工具，多種載體可在COS-7細胞中表達外源基因〔11〕。本文采用成功構建的真核表達載體pcDNA3.0/hTRX轉染宿主細胞系COS-7對hTRX基因的真核表達進行了初步研究。RT-PCR檢測證實hTRX基因至少在轉錄水平上有表達。為進一步pcDNA3.0-hTRX轉染內皮細胞，探討hTRX基因的生物學活性及其在內皮細胞氧化應激過程中的作用奠定了基礎。

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