糖尿病大鼠組織非酶糖化、細胞凋亡與糖尿病腎病的關系

劉長山 王秀軍 柳 林 孫麗萍 劉海霞 明 義 (濰坊市人民醫院內分泌科，山東 濰坊 261041)

高血糖導致的蛋白質非酶糖化是糖尿病腎病(DN)的重要發病機制〔1〕。有研究證明細胞凋亡參與了DN發生的整個過程。但非酶糖化與細胞凋亡的關系研究資料不多。本研究制備糖尿病大鼠動物模型，測定組織非酶糖化，觀察腎臟細胞凋亡形態學改變及凋亡相關蛋白的表達，并予以非酶糖化抑制劑氨基胍進行干預治療，以研究非酶糖化與細胞凋亡的關系，探討抑制非酶糖化、防止細胞凋亡進而防治DN可能性。

1 材料與方法

1.1 動物、主要藥品、試劑及儀器 清潔級雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，6周齡，健康，由山東大學實驗動物中心提供，合格證SCXK(魯)20030004。鏈脲佐菌素(STZ):美國Alexi公司。氨基胍:美國Sigma公司產品。Bcl-2、Bax免疫組化測定藥盒:北京中杉金橋生物技術有限公司。尿白蛋白測定試劑盒:天津DPC公司。One Touch血糖儀:美國強生公司。H-7500透射電鏡，850型熒光分光光度計:日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠動物模型的建立 Wistar雄性大鼠30只，適應性喂養1 w后，隨機取10只為正常對照組喂養常規飼料。其余20只擬作為DN組，左下腹腔按60 mg/kg體重單次注射STZ溶液，注射后72 h斷尾取血測血糖(One Touch血糖儀)，血糖≥16.7 mmol/L為DN模型建立，并納入本實驗。

1.2.2 實驗動物分組及藥物干預過程 將20只模型大鼠隨機分為2組進行試驗，DN組，氨基胍治療組;每組10只，各組間血糖值相差不大于1 mmol/L。大鼠在造模成功后即開始給藥，每日灌胃給藥1次，氨基胍組100 mg·kg-1·d-1，糖尿病對照組和正常對照組應用等容量生理鹽水1 ml/100 g/d。灌胃開始后第4，8，12，16 w分別測定血糖和留取24 h尿液測定尿白蛋白定量，并記錄結果。實驗過程中，大鼠死亡1只，共29只大鼠完成全部實驗研究。

1.2.3 動物處死與標本制備 16 w時，用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠處死大鼠。取右腎組織放于4%中性甲醛中固定，備進行免疫組化染色。取左腎少量皮質，備進行電鏡觀察。取左腎剩余皮質稱重，置于-70℃冰箱保存，備進行非酶糖化測定。

1.2.4 腎皮質晚期糖化終產物(AGEs)測定 參照Nakayama等〔2〕和 Brownless等〔3〕方法進行羥脯氨酸含量測定，將測得的羥脯氨酸值乘以因子7.14，即為膠原含量。最后腎皮質中AGEs含量以每mg膠原中相對熒光強度(AUF/mg)表示。

1.2.5 Bcl-2、Bax蛋白免疫組織化學染色 常規石蠟切片，透明、復水，按1∶100比例稀釋的小鼠抗大鼠Bax和Bcl-2抗體，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根過氧化物酶標記的卵白素工作液，DAB顯色。

1.2.6 腎組織透射電子顯微鏡超微結構觀察 將腎組織切成1 mm3左右的小塊，用3%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，Epon812包埋。用透射電鏡下觀察并拍照。每只動物的腎組織隨機選12處腎小球基底膜和12處系膜區拍照，然后用圖像分析處理儀計算出每個腎組織的平均腎小球基底膜厚度和平均系膜間隙面積。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件進行處理，數據以±s表示，各組數據間的比較采用t檢驗和單因素方差分析。

2 結果

2.1 實驗前后大鼠體重與血糖水平 藥物干預前DN大鼠體重與正常對照組均無明顯差異(P＞0.05)，血糖均顯著高于正常對照組(P＜0.01);治療16 w結束時，DN大鼠體重明顯低于正常對照組，氨基胍治療組血糖與治療前比較無顯著差異(P＞0.05)，DN兩組間體重無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 氨基胍對DN大鼠腎組織非酶糖化的影響 治療結束時，DN組AGEs含量明顯高于正常對照〔(251.09±51.74)，(118.34±21.51)AUF/mg，P ＜0.01〕，氨基胍治療組 AGEs含量明顯低于DN組〔(139.18±36.4)AUF/mg，P＜0.01〕。

2.3 實驗后各組DN大鼠尿白蛋白定量變化 隨著實驗時間的進展，糖尿病組大鼠尿白蛋白有上升趨勢，用氨基胍治療后尿白蛋白基本維持不變，治療16 w末，氨基胍組尿白蛋白水平與4 w末相當，但糖尿病對照組尿白蛋白定量顯著升高。見表2。

2.4 腎臟透射電子顯微鏡觀察加細胞計量 DN組大鼠腎小球基底膜厚度明顯高于正常對照組，用氨基胍治療后，治療組GBM厚度明顯低于DN組但仍厚于正常組。腎小球系膜間隙面積DN組明顯高于正常對照組。應用氨基胍治療后，系膜間隙顯著低于DN組，與正常對照組差異無顯著性。見表3。

表1 各組大鼠體重和血糖比較(±s)

表1 各組大鼠體重和血糖比較(±s)

組別 n 體重(g)實驗前 實驗16 w后血糖(mmol/L)實驗前 實驗16 w后正常對照組 10 272.2±12.3 505.4±55.6 7.13±1.02 7.52±0.90 DN組 9 272.8±14.5 315.5±24.3 21.39±4.28 21.86±4.41氨基胍治療組 10 271.8±10.2 298.2±26.9 20.89±4.60 22.41±4.19

表2 大鼠4～16 w尿白蛋白含量變化(x ± s，mg/L)

表3 腎小球基底膜厚度和系膜間隙面積(±s)

表3 腎小球基底膜厚度和系膜間隙面積(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與DN組比較:2)P＜0.05

組別 n 腎小球基底膜厚度(nm) 系膜間隙面積(μm2)10 193.0±6.87 10.66±2.36 DN組 9 221.2±7.291) 16.66±3.401)氨基胍治療組 10 222.6±6.212) 12.71±2.582)正常對照組

2.5 凋亡相關蛋白免疫組織化學染色結果

2.5.1 Bcl-2蛋白表達結果 Bcl-2蛋白主要位于腎小管，在細胞漿和細胞膜表達。正常對照組大鼠腎臟Bcl-2蛋白明顯表達，DN組腎小管Bcl-2蛋白表達減少，而氨基胍治療組Bcl-2蛋白表達較DN組增多。

2.5.2 Bax蛋白表達結果 Bax蛋白在腎小球、腎小管均有表達，表達在胞漿內。正常對照組表達較弱，DN組蛋白表達明顯增多，而氨基胍治療組Bax蛋白表達較DN組有所減少。

2.6 透射電子顯微鏡細胞凋亡觀察 電鏡下可見正常大鼠腎小管上皮細胞有微絨毛，細胞膜完整，細胞器豐富，基底膜質膜內褶，線粒體良好，無線粒體腫脹。DN組大鼠腎組織系膜細胞局部、核內染色質趨邊濃縮、聚集、細胞核周間隙增寬，細胞線粒體明顯腫脹，細胞質吞飲泡大量增多，有的線粒體出現空泡樣改變，上皮細胞內可見凋亡小體。腎小管上皮細胞有細胞核固縮，核染色質邊集。DN大鼠腎組織基膜內有系膜基質插入，治療組大鼠腎組織細胞核固縮、染色質趨邊減輕，線粒體腫脹不明顯。

3 討論

DN的發生發展與血糖升高程度、持續時間密切相關，高血糖導致的蛋白質非酶糖化是DN的關鍵啟動因素，蛋白質的非酶糖化是指葡萄糖分子通過親核添加作用而不須酶的催化即與蛋白質的氨基相結合，葡萄糖分子中的羰基先與ε氨基結合形成醛亞胺(aldimine)，即Schiff堿，這是一個不穩定的中間產物，Schiff堿進一步經過分子重排變成比較穩定的酮胺化合物，稱為Amadori產物，Amadori產物比較穩定，反應的可逆性大大降低，Amadori產物大部分經過脫水和分子重排，形成復雜的、生理轉化率很低的大分子AGEs〔4〕，AGEs的形成引起腎小球毛細血管結構和功能的改變，導致DN發生發展。

近年來大量研究顯示，細胞凋亡在DN的發生與發展中起著重要作用，DN高血糖狀態下的代謝紊亂使細胞凋亡增加是發生DN的重要原因，多種病理類型腎病的發生發展及損傷后的修復過程均伴隨著細胞凋亡參與〔5〕。

凋亡相關基因可分為凋亡促進基因和抑制基因兩種。這兩類基因相互作用的結果決定細胞是生存還是凋亡。抑制基因中最具代表性的是Bcl-2，它可以阻止細胞凋亡〔6〕。Bcl-2基因的同源基因之一是Bax基因，它的過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于凋亡。

蛋白質非酶糖化與細胞凋亡之間存在復雜的病理生理聯系，Zoubin等發現AGEs可以通過多種途徑導致細胞凋亡，①通過調節促凋亡基因Bax Blf-1 Nip-3和抗凋亡基因Bcl-2 Mcl-1的表達，誘導細胞凋亡。②通過細胞質和線粒體途徑激活細胞凋亡相關酶(caspase-3，8，9)促使細胞凋亡〔7〕。

本實驗中發現，糖尿病時高血糖通過可能通過增加腎臟非酶糖化而調節凋亡相關基因Bcl-2和Bax的表達，誘導腎小管、腎小球細胞凋亡而參與DN的發生發展。本實驗認為氨基胍對DN的病理損害有明顯的保護作用，因而使用非酶糖化抑制劑防治DN可能起到一定的效果。

氨基胍是一種親質子肼類化合物，氨基胍比蛋白質中賴氨酸ε-氨基更活躍，通過與早期糖基化蛋白質Amadori產物或其衍生物如3-脫氧葡萄糖酮醛作用，使Amadori產物轉化為替代性Amadori產物，阻止它進一步轉變為AGEs。大量動物實驗已表明，氨基胍可明顯抑制AGEs的形成以及長期改善高血糖狀態下AGEs在血管壁上的積聚，發揮其對DN的防治作用。但其毒副作用較大，限制了臨床應用。DN病程遷延，這就決定其用藥治療的過程將是長期的甚至是終生的，藥物的副作用及費用均應考慮。尋找毒副作用小、價格低的非酶糖化抑制劑用于防治DN將是今后努力的方向。

1 DCCT:The Diabetes Control and Complications Trial Research Group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.N Engl J Med，1993;329(14):977-86.

2 Nakayama H，Mitsuhashi T，Kuwajima S，et al.Immunochemical detection of advanced glyclation end products in lens crystallins from streptozocininduced diabetic rat〔J〕.Diabetes，1993;42(2):345-50.

3 Brownlee M，Vlassara H，Kooney A，et al.Aminoguani N dine prevents diabetes-induced arterial wall protein cross-linking〔J〕.Science，1986;232(4757):1629-32.

4 Gohda T，Tanimoto M，Moon JY.Increased serum endogenous secretory receptor for advanced glycation end-product(esRAGE)levels in type 2 diabetic patients with decreased renal function〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2008;81(2):196-201.

5 Sano K，Fujigaki Y，Miyaji T，et al.Role of apoptosis in uranyl acetateinduced acute renal failure and acquired resistance to uranyl acetate〔J〕.Kidney Int，2000;57(4):1560-70.

6 Tsujimoto Y，Croce CM.Analysis of the structure，transcripts，and protein products of bcl-2，the gene involved in human follicular lymphoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83(14):5214-8.

7 Alikhani Z，Alikhani M，Boyd CM，et al.Advanced glycation end products enhance expression of pro-apoptolic genes and stimulate fibroblast apoptosis through cytoplasmic and mitochondrial pathway〔J〕.J Bio Chem，2005;280(13):12087-95.