Caspase-3在骨髓間充質干細胞回輸腦缺血再灌注模型大鼠腦組織中的表達

李梅笑 李 卓 鄒立華 吳 軍 (深圳市龍崗區人民醫院，廣東 深圳 58000)

腦出血可造成中樞神經系統損傷，損傷后的神經再生及功能恢復備受關注。骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)以多向分化、分泌營養因子、免疫原性弱并可透過血腦屏障在病灶定居等優點，成為治療腦血管疾病的有效方法〔1～3〕。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar大鼠60只，清潔級，體重(270±20)g;Wistar大鼠乳鼠5只，清潔級，體重(10±2)g，由吉林大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為正常對照組、模型組及MSCs治療組，每組20只。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養基(GIBCO公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(TAKARA公司)、倒置顯微鏡(Olympus公司)、PCR儀(eppendorf公司)、凝膠成像系統(伯樂公司)

1.3 MSCs的分離、培養 無菌分離Wistar大鼠乳鼠股骨，取出骨髓，制備成單細胞懸液，以1×105/ml接種于培養瓶中，當細胞長至80%進行傳代，傳至3～6代備用。

1.4 MSCs誘導神經樣細胞 選用第3代的MSCs，調細胞濃度為5×105/ml，接種到鋪有蓋片的6孔板中，12 h后更換培養基 DMEM/F12(含 2%B27，EGF 40 ng/ml，bFGF 20 ng/ml)，倒置顯微鏡觀察細胞形態變化和生長狀況，每隔2 d半量換液1次，7 d后固定細胞。免疫組織化學染色檢測NSE表達。

1.5 大腦中動脈MCAO/再灌注模型的制備 根據Longa等報道方法〔4〕，結合朱繼等改良的線栓法建立大鼠右側MCAO/再灌注模型〔5〕。采用3.5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，固定動物，呈仰臥位，頸部皮膚消毒，經頸部正中切口，分離肌肉和筋膜，暴露右側的頸總動脈 (CCA)、頸外動脈 (ECA)和頸內動脈 (ICA)，動脈夾夾閉ICA和ECA，小剪刀在頸外動脈殘端做一切口，將預先準備好的栓線 (表面涂有肝素)從ECA緩慢插入ICA，去除ICA處的動脈夾，用直鑷子將栓線緩慢沿ICA的入顱方向推進，在漁線進入約18～20 mm處微感到阻力時，栓線已經通過大腦中動脈的起始部，完成一側大腦中動脈的阻塞。移除動脈夾，清理術野，全層縫合傷口。栓塞大腦中動脈2 h后打開手術切口，輕輕拔出線栓，待栓頭到達分叉處停止，實施再灌注，清理術野，關閉手術切口。

1.6 RT-PCR方法檢測caspase-3 mRNA的表達 模型大鼠制備成功后2 h，MSCs治療組經大鼠尾靜脈回輸于模型組大鼠，細胞濃度為1×106/ml，回輸1 ml，24 h后再回輸一次，回輸第7天，斷頭取腦，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，根據GenBank上登陸的caspase-3基因序列，以β-actin為內參照，設計、合成引物。β-actin上游引物:5'GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT 3'，下游引物:5'AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT 3'，片段大小為147 bp;caspase-3上游序列:5'CTGGACTGCGGTATTGAG 3'，下游序列:5'AATCAAATCCGATGTTCC 3'，片段大小為489 bp。進行RT-PCR反應，1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果

2.1 免疫組化檢測MSCs誘導神經樣細胞NSE表達 MSCs加入誘導液后，倒置顯微鏡觀察6 h后細胞形態無明顯變化，24 h后可見部分細胞突起，7 d后細胞變成多角形、錐形，類似神經樣細胞形態(見圖1)，神經細胞球免疫細胞化學染色呈NSE陽性表達;而MSCs未誘導的神經樣細胞呈NSE陰性表達。見圖2。

2.2 RT-PCR方法檢測caspase-3 mRNA的表達 治療組caspase-3表達明顯低于模型組(P＜0.05)。治療組caspase-3表達接近于對照組(P＞0.05)。見圖3、圖4。

圖1 顯微鏡觀察MSCs誘導神經樣細胞(×100)

圖2 MSCs誘導神經樣細胞NSE表達(×200)

圖3 RT-PCR檢測caspase-3 mRNA在MSCs回輸腦缺血再灌注大鼠中表達

圖4 RT-PCR檢測β-actin在MSCs回輸腦缺血再灌注大鼠中mRNA表達

3 討論

在缺血腦組織的不同部位可見神經細胞凋亡〔6，7〕。caspase家族在凋亡過程中起重要作用，凋亡的最后過程是通過caspase的激活而實現的。活化的caspase通過酶解不同的底物蛋白產生不同的生物效應:(1)對凋亡抑制因子進行滅活;(2)破壞細胞結構;(3)通過分離蛋白的催化及調控功能區使其獲得或失去一定的功能，從而進一步調控相關的下游事件，如細胞皺縮、膜發皰、染色質聚集、DNA片斷化等，導致凋亡的典型形態學改變。各種引起凋亡的因素，如Fas死亡因子、腫瘤壞死因子、P53等均需要激活caspase-3才能導致細胞凋亡。MSCs可隨血液循環到達全身其他器官組織，參與生理更新和病理損傷修復。MSC可分化為神經樣細胞〔8〕，可以取代已經死亡的神經細胞。腦梗死后神經再生及神經功能恢復與病灶區及病灶周圍的血管發生、重塑密切相關〔9〕。MSCs能分泌腦源性神經營養因子、神經生長因子、血管內皮生長因子、肝細胞生長因子等，對神經功能的恢復發揮重要作用。MSCs與神經干細胞共培養，MSCs能誘導神經干細胞分化為神經元。本實驗成功地將MSCs誘導為神經樣細胞。MSCs回輸腦缺血再灌注模型大鼠后caspase-3基因下調，抑制神經細胞凋亡。治療組caspase-3表達明顯低于模型組，具有統計學意義。治療組caspase-3表達接近于對照組。由于MSCs具有體外培養擴增比較容易且免疫原性小的優點，異體移植可修復損傷的組織或治療相應組織病變，為腦缺血治療理想的種子細胞。

1 Chivu M，Dima SO，Stancu CI，et al.In vito hepatic differentiation of human bonemarrow mesenchymal stem cells under differential exposure to liver-specific factors〔J〕.Transl Res，2009;154:122-32.

2 Violini S，Ramelli P，Pisani LF，et al.Horse bone marrow mesenchymal stem cells express embryo stem cell markers and show the ability for tenogenic differentiation by in vitro exposure to BMP-12〔J〕.BMC Cell Biol，2009;10:29-34.

3 Jin JD，Wang HX，Xiao FJ，et al.A novel rich source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow samples〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;376(1):191-5.

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20:84-91.

5 朱 繼，萬 東，唐文淵.改良線栓法制備大鼠局灶腦缺血模型〔J〕.第四軍醫大學學報，2008;29(8):685-7.

6 Niwa M，Hara A，Iwai T，et al.Caspase activation as an apoptotic evidence in the gerbil hippocampal CA1 pyramidal cells following transient forebrain ischemia〔J〕.Neurosci Lett，2001;300(2):103-4.

7 Namura S，Zhu J，Fink K，et al.Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia〔J〕.J Neurosci，1998;18(10):3659-60.

8 Chao YX，He BP，Cao Q，et al.Protein aggregate containing neuron like cells are differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells from mice with neurofilament light subunit gene deficiency〔J〕.Neurosci Lett，2007;417:240-5.

9 Toyama K，Honmou O，Harada K，et al.Therapeutic benefits of angiogenetic gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischemia〔J〕.Exp Neurol，2009;216:47-55.