TGF-β抑制劑Decorin對AngⅡ調節人臍靜脈內皮細胞Toll樣受體2表達的影響

方 玲 劉先哲 余 旻 鮑榮輝 胡藝瓊 朱志林 井 景 劉曉光 李俊明

(宜昌市第一人民醫院心內科，湖北 宜昌 443002)

在動脈粥樣硬化(AS)發生、發展過程中，活化的Toll樣受體2(TLR2)能夠促進內膜粥樣斑塊形成及AS進展〔1，2〕，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)則作用于心血管的特異性受體，通過各種不同途徑，最終引起 AS〔3〕，轉化生長因子 β(TGF-β)在 AS 過程中則可以延緩AS病變的發展過程，從而發揮保護性作用〔4，5〕。早期實驗已經證實AngⅡ能夠使細胞TGF-β的表達增加〔6〕，同時TGF-β可調節AngⅡ誘導心室重構〔7〕。近期實驗發現TGF-β對不同配體誘導的TLR2表達的調控具有不同的作用〔8，9〕。本課題前期實驗已經證實了AngⅡ能夠下調體外培養的人臍靜脈內皮細胞(HECV)TLR2表達，本文采用 TGF-β的抑制劑Decorin刺激體外培養的HECV，觀察TGF-β在AngⅡ對 TLR2表達影響的過程中有何種作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HECV-304購自武漢典型培養物保藏中心細胞庫;RPMI1640培養基、胰蛋白酶、AngⅡ購自Sigma公司;Decorin購自R＆D公司;胎牛血清購自杭州四季青生物技術有限公司;Trizol試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司;實時定量PCR各種試劑均購自Promega;DNA Maker購自TaKaRa公司;Western及免疫沉淀(IP)細胞裂解液購自碧云天生物技術研究所;TLR2一抗、二抗購自R＆D公司;蛋白Marker購自Fermentas公司;DAB試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HECV-304的傳代培養及分組收到定購的細胞后先將培養瓶內的培養液在超凈工作臺內用吸管全部吸出，置于另一無菌容器，再向培養瓶中加入1 ml胰蛋白酶，37℃消化直到細胞脫落，換新的培養瓶，加入吸出的培養液5 ml，在37℃，5%CO2培養箱培養，當細胞生長到90%以上單層融合狀態時，即可加入胰蛋白酶進行消化，按1∶2進行傳代培養。細胞分為①正常對照組:取2瓶處于對數生長期的HECV-304細胞進行1∶2傳代(傳代后調節細胞濃度為104/ml，每瓶接種細胞懸液5 ml)，待細胞貼壁后(約傳代后4 h)每瓶細胞分別加入高壓滅菌的PBS溶液100μl，培養20 h后每瓶細胞內加入高壓滅菌的三蒸水500μl，繼續培養1 h。②AngⅡ刺激組:取2瓶處于對數生長期的HECV-304細胞進行1∶2傳代(傳代后調節細胞濃度為104/ml，每瓶接種細胞懸液5 ml)，恒溫培養24 h后每瓶細胞分別加入 10-4、10-5、10-6、10-7mol/L 的 AngⅡ溶液 500 μl，繼續培養1 h。測定各組細胞TLR2蛋白及基因的表達量。②AngⅡ+Decorin刺激組:取2瓶處于對數生長期的HECV-304細胞進行1∶2傳代(傳代后調節細胞濃度為104/ml，每瓶接種細胞懸液5 ml)，待細胞貼壁后(約傳代后4 h)每瓶細胞分別加入80、40、20、10 μg/ml的 Decorin溶液100 μl，培養20 h后每瓶細胞內加入10-5mol/L的AngⅡ溶液500μl，繼續培養1 h。

1.2.2 實時定量PCR各組細胞按照上述分組方法處理后收集并提取總RNA 采用Trizol試劑一步法抽提，并對抽提的RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，以確定RNA的純度及完整性。實時定量PCR采用兩步法:各組RNA定量2μg、5×逆轉錄緩沖液4μl、100 mmol/L二硫代蘇糖醇(DTT)1μl、100 μmol/L Oligo(dT15)1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl加 DEPC 處理水至總體積為18μl，稍離心65℃溫育5 min后置于冰上，加入逆轉錄酶(MMLV)逆轉錄酶(100 U/μl)2 μl，37℃ 逆轉錄60 min，94℃ 5 min滅活逆轉錄酶。PCR反應體系:0.5 mmol/L dNTP 1 μl、10 × PCR 緩沖液 2 μl、25 mmol/L MgCl22 μl、2.5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.4 μl、滅菌三蒸水 9.6 μl、反轉錄產物2μl、4μmol/L上游引物 1 μl、4 μmol/L下游引物 1 μl、Taqma探針1μl。PCR反應條件為:預變性94℃ 3 min、變性95℃10 min 1個循環，退火95℃ 15 s、延伸56℃ 1 min 40個循環。TLR2上游引物序列:5'-CTACTGGGTGGAGAACCTTATGGT-3'，TLR2下游引物序列:5'-CCGCTTATGAAGACACAACTTGA-3'，cDNA 長度77 bp，TLR2 探針序列:5'-CAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCC-3';GAPDH上游引物序列:5'-GAAG-GTGAAGGTCGGAGTC-3'，GAPDH下游引物序列:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，cDNA 長度225 bp，GAPDH 探針序列:5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'。PCR產物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳(90 V，20 min)，Gene Genius凝膠分析系統成像。

1.2.3 Western印跡 各組細胞按照上述分組方法處理后采用Western及IP細胞裂解液一步法，收集并制備蛋白樣品。各取含蛋白樣品50μg的提取液，以濃縮膠體積分數為4%，分離膠體積分數為10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠120 V，分離膠80 V，電泳4～5 h分離。電泳完畢后用半干電轉移槽轉移至硝酸纖維素膜上(60 V轉移2 h)，在室溫下用封閉液(5%脫脂奶粉，0.05%Tween20，TBS)封閉1 h。然后依次與 TLR2的一抗、二抗在室溫下孵育1～2 h，DAB顯色并照相。

1.3 統計學處理 采用SPSS10.0統計軟件進行分析，數據資料以±s表示，單因素方差分析。

2 結果

2.1 TGF-β抑制劑 Decorin減弱 AngⅡ對體外培養 HECV TLR2蛋白表達的下調作用 以β-actin為內參照，在加入相同量蛋白樣品的情況下，AngⅡ+Decorin刺激組TLR2蛋白的表達量明顯高于AngⅡ刺激組。見圖1、圖2。

2.2 TGF-β抑制劑 Decorin減弱 AngⅡ對體外培養 HECV TLR2基因表達的下調作用 GAPDH為內參照，在加入相同量RNA的情況下，AngⅡ+Decorin刺激組TLR2基因的表達量明顯高于AngⅡ刺激組，與正常對照組相比差異有統計學意義(0.864 0)，在沒有Decorin刺激時TLR2基因的表達量明顯降低(0.000 2)，10μg/ml Decorin刺激后TLR2基因的表達有所升高(0.005 6)，并隨 Decorin濃度增大表達升高越明顯，80μg/ml Decorin刺激后 TLR2基因的表達升至最高(0.381 2)，差異有統計學意義。見表1，圖3。

表1 TGF-β抑制劑Decorin在AngⅡ對TLR2基因調控中的影響(±s)

表1 TGF-β抑制劑Decorin在AngⅡ對TLR2基因調控中的影響(±s)

與10-5 mol/L AngⅡ組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;CT值為RT-PCR后得出的各基因的相對表達量，根據公式△CT=CTTimeX-CTTime0計算出2-△△CT，然后進行統計分析;目的基因CT代表TLR2基因的相對表達量;內參基因CT代表管家基因GADPH的相對表達量

組別 目的基因CT 內參基因CT 2-△△CT 20.697 3±0.275 0 7.082 3±0.363 9 0.000 2 10μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ組 18.349 7±0.350 4 9.095 7±0.287 3 0.005 61)20μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ組 22.683 7±0.278 2 16.598 0±0.230 5 0.028 92)40μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ組 21.222 7±0.173 1 16.826 7±0.210 6 0.093 22)80μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ組 9.842 3±0.139 3 7.478 3±0.171 2 0.381 22)10-5 mol/L AngⅡ組

圖1 AngⅡ+Decorin刺激組TLR2蛋白表達

圖2 AngⅡ刺激組TLR2蛋白表達

圖3 實時定量PCR產物電泳圖

3 討論

AS的炎癥浸潤通常存在于動脈壁的內膜層和外膜層，作為動脈內膜的最主要組成細胞，已經證實了內皮細胞在動物模型中參與了內膜的損傷，AngⅡ以自分泌或旁分泌的方式作用于循環系統的特異性受體，從而影響血流動力學，引起內皮細胞功能紊亂和動脈炎癥的發生，并最終導致AS的發生〔10〕。同時越來越多的證據表明血管內皮細胞表達的TLR2能夠通過不同的途徑引起促炎細胞因子與趨化因子的大量釋放，導致炎癥細胞的活化、血管平滑肌細胞(VSMC)的遷移和增殖、單核細胞的募集，促進內膜粥樣斑塊的形成。另外，TGF-β在AS過程中通過抑制VSMC的遷移、促進ECM的形成、抑制血管內皮促炎黏附分子的表達以及減少體外培養巨噬細胞泡沫細胞的形成等作用延緩AS病變的發展過程，從而發揮保護性作用。已經有研究證實TGF-β對不同配體引起的體內外TLR2的表達具有不同的影響作用，但TGF-β抑制劑Decorin在AngⅡ對TLR2表達調控中的作用還沒有研究過。本實驗發現 TGF-β抑制劑Decorin減弱了AngⅡ對TLR2蛋白及基因表達的下調作用，并且隨著其濃度的增加加強作用越強，但另一方面，還必須弄清楚TGF-β本身對TLR2的表達具有什么影響，這樣才能更加準確地知道TGF-β的作用到底是通過AngⅡ或其他因子實現的還是直接影響了TLR2，同時在實驗中選取的Decorin濃度有限，只有4個不同濃度，無法預知在其濃度更大或更小時對TLR2的表達有沒有影響，影響與目前的實驗結果是否一致，目前關于TGF-β-AngⅡ-TLR2之間調節的具體機制和信號通路還十分模糊，還需要通過進一步的實驗來證實。

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