豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法與常規檢測方法的比較

宋 立，高志強，楊承槐，寧宜寶，張鶴曉，吳 丹，張利峰，劉 洋

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081;2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026)

目前臨床常用檢測豬鏈球菌的方法有細菌分離培養和PCR方法［1］。細菌分離培養是傳統的診斷、檢測方法，所需時間較長，鑒定相對有一定難度。常規PCR方法不能定量，敏感性不夠高。熒光PCR技術是20世紀90年代末發展起來的分子生物學檢測新技術，其原理是將熒光基團加入PCR反應體系，利用熒光信號累積實時監測整個PCR過程，并能通過標準曲線對未知核酸模板進行定量分析。由于該項技術克服了常規PCR不能定量檢測的缺點，且特異性和敏感性較常規PCR大幅提高，因此在醫學和獸醫領域均得到廣泛運用［2－4］。

致病性豬鏈球菌2型為人畜共患傳染病病原菌，在動物中可引起豬的腦膜炎、心內膜炎、關節炎、肺炎和敗血癥等。該病原致病性強、傳播迅速，如果不及時治療，可導致發病動物急性死亡。豬鏈球菌病在我國各地時有發生，在局部地區呈暴發勢態［5－6］，并常有感染人類的報道［7－8］，給人類健康帶來威脅。因此，選擇一種快速、靈敏的檢測方法用于臨床樣品檢測，及時發現帶菌食品和動物，對于豬鏈球菌病的及時預防和畜產品進出口檢驗檢疫均有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

1.1.1.1 豬鏈球菌2型R735 由加拿大特利爾大學Marcelo Gottschalk教授惠贈，試驗濃度CFU為42 ×106/0.1 mL。

1.1.1.2 豬鏈球菌2型C55606 從中國獸醫藥品監察所菌種中心領取，試驗濃度CFU為52×106/0.1 mL。

1.1.1.3 豬鏈球菌四川株 中國獸醫藥品監察所2005年從四川豬鏈球菌2型發病豬體內分離，經API Strep拭條鑒定為豬鏈球菌2型。

1.1.2 試驗小鼠和豬 小鼠為1月齡小白鼠，由中國獸醫藥品監察所基礎保障室提供。豬為廣東永順生物制藥有限公司動物場飼養的二元長白(♂)與香豬(♀)的雜交一代，均為45日齡，體重20 kg。

1.2 方法

1.2.1 對臨床樣品檢測的敏感性和實用性比較

1.2.1.1 對發病小鼠樣品的檢測 用豬鏈球菌2型四川株馬丁肉湯20 h新鮮培養物，腹腔注射1月齡小鼠，每只1 mL，約3800個菌，攻菌后2 d死亡2/5。無菌取出死亡小鼠肝臟，與陰性對照小鼠肝臟一同用熒光PCR檢測方法和常規細菌分離法檢測病原，比較兩種方法的敏感性和實用性。

1.2.1.2 對發病豬樣品的檢測 用豬鏈球菌2型HA9801株(廣東永順生物制藥有限公司制備，疫苗檢驗用強毒株)攻擊試驗用豬4頭(1#、2#、3#和4#)，每頭1.74 ×107CFU。1#和2#豬感染瀕死后，馬上剖殺取臟器;3#豬攻毒后48 h死亡，死亡后24 h剖殺取臟器;4#豬攻菌后66 h死亡，死亡后6 h解剖取臟器。用熒光PCR檢測方法、常規PCR方法和細菌分離法對感染豬的臟器(心、肝、脾、腎、扁桃體實質臟器和血液、喉拭子)進行檢測，并設陰性對照，比較3種方法對臨床樣品的敏感性和實用性。1.2.1.3 熒光PCR檢測方法 用北京出入境檢驗檢疫局和中國獸醫藥品監察所制備的豬鏈球菌熒光PCR檢測試劑盒，批號為2005002，按使用說明書操作步驟進行。

1.2.1.4 常規細菌分離法 首先將樣品分別接種于綿羊血瓊脂平板，37℃培養40 h，長出的可疑菌落用豬鏈球菌2型陽性血清進行平板凝集試驗，能被特異性陽性血清凝集的為陽性，不能被凝集的為陰性。

1.2.1.5 普通PCR檢測方法 上游引物Cps2J－s，5’－ GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T －3’;下游引物Cps2J－as，5’－CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C－3’。目的片段長度為450 bp左右。

1.2.2 檢測靈敏度的比較 將豬鏈球菌2型R735、豬鏈球菌2型 C55606分別稀釋至10－9，用熒光PCR和常規PCR方法進行檢測，并做細菌CFU測定，比較檢測靈敏度。

2 結果

2.1 熒光PCR檢測結果的判定 Ct值≤35.0，且擴增曲線出現特異性指數擴增區，則為豬鏈球菌2型陽性;無Ct值或無特異性指數擴增區，則為豬鏈球菌2型檢測陰性(圖1)。

圖1 豬鏈球菌2型熒光PCR檢測示意圖

2.2 PCR檢測結果的判定 電泳出現450 bp左右條帶的判為陽性，否則為陰性(圖2)。

圖2 豬鏈球菌2型PCR檢測示意圖

2.3 對發病小鼠樣品檢測結果的比較 2只發病小鼠肝臟組織熒光PCR檢測呈陽性，而對照呈陰性。與常規細菌分離法檢測結果一致。

2.4 對發病豬樣品檢測結果的比較 用細菌分離法對1#～4#豬細菌分離結果如表1所示。病死后立即取出的病料樣品，細菌分離法檢出率為100%;死亡數小時后才取出的病料樣品，細菌分離率大幅下降。3種方法對2#～4#豬病料的檢測結果如表2所示。結果表明對于病死后不同時間采到的病料樣品，熒光PCR方法的檢測率最高，為70.8%(17/24)，其次是細菌分離法45.8%(11/24)，常規PCR方法檢出率最低，為20.8%(5/24)。

2.5 靈敏度檢測結果的比較 將 10－5、10－6、10－7和10－8每個稀釋度取0.1 mL接種于血平板，37℃培養40 h后進行細菌計數，計算CFU。結果R735株CFU為42×106/0.1 mL;C55606株CFU為52×106/0.1 mL。熒光 PCR 檢測滴度可達 10－6，而普通PCR僅能達到10－4。

表1 1#～4#豬病料細菌分離結果

表2 3種方法對2#～4#豬病料的檢測結果

3 分析與討論

3.1 從常規的細菌分離法來看，1#和2#豬死亡后及時采樣，血液以及其他實質器官和喉拭子均長出α溶血的鏈球菌可疑菌落，長菌量排列依次為血→肺和脾→肝和扁桃體→喉拭子→心和腎，用特異性陽性血清鑒定，均為豬鏈球菌2型。但在細菌培養過程中，除血外，其他樣品還長出少量雜菌，表明臨床樣品通常存在其他細菌的污染。3#和4#豬攻菌死亡后未及時采樣，心、脾、腎、肺、扁桃體和喉拭子以長出淺綠色、濕潤、圓形、中等大小菌落為主，有β溶血環，經革蘭氏染色鏡檢，菌落為G－桿菌，初步判斷為綠膿桿菌。由于該菌生長速度快，幾乎覆蓋了豬鏈球菌的生長。只有4#豬血液能長出一些α溶血的被檢菌落，肝和肺見到少量被檢菌。該試驗充分說明傳統細菌分離法操作繁瑣、耗費時間較長，對被檢樣品純凈度要求較高，污染雜菌則檢出率會大幅下降，但臨床樣品很難做到不受其他細菌的污染。

3.2 從表2的檢測結果來看，豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法具有顯著的優點。24份臨床感染豬器官樣品，該方法檢出率為70.8%，普通PCR法檢出率僅為20.8%，所以該方法敏感性高于普通PCR方法。常規細菌分離法為公認的標準檢測方法，檢出率也只為45.8%，主要由于臨床樣品受其他細菌污染，生長較快的雜菌很快把豬鏈球菌覆蓋。用熒光PCR檢測方法，幾乎不受雜菌污染的限制，所以熒光PCR這一新型的檢測技術，是在普通PCR原有一對特異性引物基礎上增加特異性的熒光雙標記探針，在儀器上通過對熒光信號累計的感應和信息處理，使抗原核酸呈特異性S型擴增曲線表示出來，使其在普通PCR基礎上，大大增強了對病原體檢測的特異性、敏感性和靈敏度，并能定量分析。在樣品帶菌狀況監測和進出口檢驗檢疫中，該方法快速、靈敏、操作方便，完全可以取代常規細菌分離法。但該方法只能做病原核酸的檢測，如需分離病原做進一步調查研究，就必須采用經典的細菌分離法。

3.3 對于豬鏈球菌2型實驗室培養的菌液，熒光PCR檢測方法的靈敏度也明顯高于常規PCR方法，熒光PCR檢測滴度可達10－6/0.1 mL(42～52 CFU/0.1 mL);而普通PCR僅能達到10－4。

致謝:廣東永順生物制藥有限公司為本試驗提供了陽性豬和陰性豬樣品，在此感謝王少英總工的無私幫助和支持。

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