丹參酮ⅡA對低分化鼻咽癌細胞氯通道的激活作用

李 媛，劉善文，李華榮，馬文波，潘廷才，朱林燕，葉文才，王立偉，陳麗新

(暨南大學1.醫學院藥理學系、2.醫學院生理學系、3.藥學院，廣東廣州 510632)

丹參是臨床常用中藥，廣泛應用于治療心血管疾病，具有擴張血管、降壓、抗血栓的功能，對治療冠心病、心絞痛、心律過速有明顯療效［1］。丹參酮ⅡA(TanⅡA)是丹參的主要提取物之一。近年來，人們發現丹參酮ⅡA對多種腫瘤細胞具有抑制增殖，促進凋亡，誘導分化的作用［2］。我們前期的研究表明［3-4］，氯通道在細胞增殖、細胞周期中發揮重要作用，與順鉑誘導的低分化鼻咽癌細胞凋亡相關。本實驗擬采用全細胞膜片鉗技術直接觀察丹參酮ⅡA對低分化鼻咽癌細胞氯離子通道的激活作用，并分析丹參酮ⅡA誘導的電流特征，為進一步闡明丹參酮ⅡA誘導細胞凋亡的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞培養低分化鼻咽癌細胞CNE-2Z用含10% 新生牛血清(Gibco，美國)、1 × 105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的 RPMI 1640培養液(Gibco，美國)在 37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中，按常規方法傳代。實驗前消化細胞，將細胞懸液接種在直徑22 mm的圓形玻片上，放入培養箱，待細胞貼壁1 h后進行實驗。

1.2主要試劑及來源丹參酮ⅡA購自深圳美荷生物科技有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)配制成10 mmol·L-1儲存液，使用前用細胞灌流液稀釋至1 nmol·L-1;氯通道阻斷劑 5-nitro-2-(3-henylpropylamino)benzoic acid(NPPB)，用 DMSO配制成100 mmol·L-1儲存液，使用前稀釋至 100 μmol·L-1。除特殊說明外，所有的試劑和藥品均購于美國Sigma公司。

1.3細胞外灌流液等張灌流液滲透壓為300 mOsm·L-1，含(mmol·L-1):70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和140 D-甘露醇。高張灌流液滲透壓為440 mOsm·L-1，除增加140 mmol·L-1D-甘露醇外，其它成份和濃度與等張灌流液相同。灌流液用Tris-base液調pH值至7.40，用冰點滲透壓計(Osmomat030;Gonotec，Germany)檢測滲透壓。

1.4電極內液電極內液含(mmol·L-1):70N-methyl-D-glucamine chloride(NMDG-Cl)、1.2 MgCl2、10 HEPES、1 EGTA、140 D-甘露醇和 2 ATP，用 Trisbase調pH值至7.25，用孔徑0.22 μm的無菌過濾器過濾。滲透壓為300 mOsm·L-1。

1.5全細胞膜片鉗記錄用EPC-7膜片鉗放大器(List Electronic，Germany)記錄單個細胞的全細胞電流。電流和電壓信號用 CED1401(Cambrige，UK)數字化(采樣頻率 3 kHz)，實驗數據用 EPC(CED，Cambridge，UK)軟件分析。在電壓鉗制模式下，細胞被鉗制在0、±40、±80 mV，每個鉗制脈沖波間隔4 s，持續200 ms，不斷反復循環。實驗在室溫(20℃ ～24℃)下進行。

貼有細胞的玻片安放在灌流槽中，全細胞記錄形成后，記錄穩定的背景電流，隨后用丹參酮ⅡA激活氯電流，記錄激活電流的潛伏期、達峰時間、電流密度等。電流達到峰值并平穩后，加入 NPPB，待電流達到最小值并平穩后終止記錄。計算NPPB對丹參酮ⅡA激活電流的抑制率。抑制率的計算公式為:抑制率/% =〔(CTan-CIso)-(CBlockers-CIso)〕/(CTan-CIso)×100%，其中CIso是等張條件下的電流值，CTan是丹參酮ⅡA激活的電流最大值，CBlockers是加入阻斷劑后的最大效應時的電流值。

在觀察丹參酮ⅡA激活氯通道的容積敏感性實驗中，當丹參酮ⅡA激活細胞電流達到峰值并穩定后，換為含相同濃度丹參酮 ⅡA的高滲灌流液，觀察滲透性細胞容積縮小對丹參酮ⅡA激活氯電流的影響。

1.6統計學處理所有數據經SPSS 13.0軟件進行統計分析，用方差分析(Anova)進行顯著性檢驗，數據用±s表示，每次實驗均重復3次以上。

2 結果

2.1丹參酮ⅡA激活CNE-2Z細胞氯通道如Fig 1A所示，細胞背景電流較小而且穩定。在-80 mV電壓鉗制下，氯離子從細胞內流向細胞外，形成內向電流，平均電流密度為(-5.6±0.9)pA/pF;在+80 mV電壓鉗制下，氯離子從細胞外流向細胞內，形成外向電流，平均電流密度為(4.8±0.6)pA/pF。隨后用含有1 nmol·L-1丹參酮ⅡA的等張灌流液連續灌流時，可激活一個電流，激活潛伏期為(67.9±18.2)s，隨藥物作用時間延長，電流逐漸增大，約(1051.5±215.3)s達到峰值進入平穩期。如Fig 1B所示，在±120 mV電壓持續 300 ms鉗制條件下，該電流沒有明顯電壓依從性失活和時間依從性失活。Fig 1C顯示了丹參酮ⅡA激活電流的全程圖。在 -80 mV電壓鉗制下，內向電流峰值的電流密度為(-54.2±13.7)pA/pF，+80 mV電壓鉗制下外向電流的電流密度為(71.0±16.1)pA/pF，外向電流較之內向電流大，表現了較明顯外向優勢(n=8，P=0.010)，該電流的翻轉電位為(-5.9±0.2)mV(n=8)，見 Fig 1D。

Fig 1 TanshinoneⅡA-induced whole-cell currents in CNE-2Z cells

2.2高張液對丹參酮ⅡA激活氯電流的抑制作用在細胞外灌流含1 nmol·L-1丹參酮ⅡA的等張灌流液，激活電流并達到峰值穩定3min后，換用含相同濃度的丹參酮ⅡA的高張液(Hyper)灌流，如Fig 2所示，440 mOsm·L-1高張灌流液可以迅速完全抑制丹參酮ⅡA激活的氯電流。Fig 2A和2B分別顯示了丹參酮ⅡA激活的氯電流和高張液的抑制作用的瞬時圖，Fig 2C顯示了高張液抑制作用的全過程。在-80 mV電壓鉗制下，高張液使丹參酮ⅡA激活的內向電流從(-54.2±13.7)pA/pF下降到(-7.1±2.3)pA/pF，抑制率為(97.0±3.2)%(n=5，P=0.005)，+80 mV 電壓鉗制下，外向電流從(71.0±16.1)pA/pF下降到(7.2±3.5)pA/pF，抑制率為(96.5±4.2)%(P=0.004)。高張液對內外向電流的抑制率差異沒有顯著性(P=0.618)，見Fig 2D。丹參酮ⅡA激活的氯電流被高張液抑制，表明該電流具有容積敏感性。

2.3氯通道阻斷劑對丹參酮ⅡA激活氯電流的抑制作用NPPB是常用的氯通道阻斷劑，本實驗觀察了NPPB對丹參酮ⅡA激活氯電流的影響。Fig 3A和3B分別 顯示了100 μmol·L-1NPPB抑制丹參酮ⅡA激活的電流的瞬時圖和全過程。電壓鉗制在 ±80 mV時，等張灌流液組(Iso)、丹參酮ⅡA組(TanⅡA)、丹參酮ⅡA+氯通道阻斷劑組(TanⅡA+NPPB)組的電流密度見Fig 3C。結果表明，NPPB可抑制丹參酮ⅡA激活的氯電流，-80 mV電壓鉗制下，內向電流從(-54.2±13.7)pA/pF下降到(-14.1±4.3)pA/pF，抑制率為(75.8±11.3)%(n=5，P=0.031)，+80 mV電壓鉗制下，外向電流從(71.0±16.1)pA/pF下降到(21.1±7.9)pA/pF，抑制率為(76.8±10.3)%(P=0.017)，NPPB對內外向電流的抑制率差異沒有顯著性(P=0.668)。

Fig 2 Inhibition of tanshinoneⅡA-induced chloride currents by hypertonic solutions

Fig 3 Inhibition of tanshinoneⅡA-induced chloride currents by chloride channel blocker NPPB

3 討論

近年研究發現丹參酮ⅡA可通過降低VEGF［5］、突變型 p53 蛋白和 Bcl-2 蛋白的表達［6］，上調 Fas、Caspase-3 mRNA［7］，抑制原癌基因 cmyc［8］和 BCRP/ABCG2 基因［9］的表達等發揮抗癌作用。

研究表明，氯通道與細胞容積調節［10-11］、細胞增殖和周期［3］、細胞遷移［12］及細胞凋亡［3，13-14］密切相關。我們前期的研究表明，氯通道參與凋亡性細胞容積減小，凋亡誘導劑順鉑和過氧化氫在短時間內激活氯通道，引起細胞內氯離子和鉀離子的外流，同時伴隨水的外流而導致細胞容積減小，誘導鼻咽癌細胞凋亡，NPPB抑制順鉑和過氧化氫誘導的凋亡，提示氯通道參與了凋亡的發生［4，13］。丹參酮ⅡA誘導凋亡的作用是否與氯通道相關，鮮見文獻報道。

本研究用膜片鉗方法，直接觀察丹參酮ⅡA對氯離子通道的激活作用，實驗結果表明，細胞外灌流低濃度丹參酮ⅡA可激活一個具有明顯外向優勢的電流，該電流在不同鉗制電壓下其電流方向和 Cl-運動方向一致，電流的翻轉電位接近于 Cl-的平衡電位(-0.9 mV)，推測該電流為氯電流。進一步實驗證實，氯通道阻斷劑NPPB可抑制該電流，因此這是一個由氯通道介導的氯電流，本結果為丹參酮ⅡA激活氯通道提供了直接的實驗證據，提示丹參酮ⅡA可能通過某些信號轉導途徑，激活細胞膜氯離子通道，誘發細胞凋亡性容積減小，誘導細胞凋亡而發揮其抗癌作用。

丹參酮ⅡA激活的氯電流具有明顯的外向優勢，無明顯的時間依從性失活和電壓依從性失活，可以被高張灌流液完全抑制，被NPPB抑制，且對內外向電流抑制作用差異無顯著性，這些特征與我們以前報道的鼻咽癌細胞容積敏感性氯通道［3］的特征相似，但容積敏感性氯通道是在細胞外低張環境或細胞內高張環境引起細胞腫脹時而激活，而本實驗中，氯通道是在等張環境、非細胞腫脹條件下而被丹參酮ⅡA激活，即激活氯通道的條件不同，提示這兩種通道的激活途徑不一樣。綜上所述，丹參酮ⅡA可以激活低分化鼻咽癌細胞氯通道，但其具體的激活途徑，以及激活氯通道后對細胞功能的影響等有待探討。

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