青蒿素對變應性接觸性皮炎小鼠Treg/Th17免疫平衡的影響

李 覃，陳 虹，韋 娜，梅 昕，那春祺，劉永峰，胡 杰

(1.天津武警醫學院免疫學教研室，2.天津市職業與環境危害生物標志物重點實驗室，3.天津武警醫學院生藥學教研室，天津 300162)

接觸性皮炎是皮膚和外物接觸后誘發的急、慢性炎癥反應，分為化學刺激引起的刺激性接觸性皮炎(irritation contact dermatitis，ICD)和免疫反應引起的變應性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)。對于ICD，找到病因避免接觸則較易治愈;而對于ACD，由于許多患者不能圓滿改善與變應原接觸的現狀，或者未得到正確的診斷與治療，常導致病情遷延難愈。而且，隨著經濟和現代工業化的發展、環境污染的加重，ACD發病率呈逐年增高趨勢。目前，ACD的常用治療藥物均有不同程度毒副作用，因此，研制療效好、副作用小的新型干預藥物就顯得尤為迫切和重要。青蒿素(artemisinin，Art)是從菊科植物黃花蒿葉中提取的一種含有過氧基團的倍半萜內酯，在臨床上已被廣泛用于治療瘧疾，具有高效低毒的特點［1］。多年來的臨床和實驗室研究發現，青蒿素殺滅瘧原蟲的作用與其免疫調節活性相關［2］。現已證實，Art對類風濕性關節炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病以及二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)誘導的小鼠ACD都能顯示出不同程度的治療或保護作用，但具體作用機制尚未完全闡明。本實驗在建立小鼠實驗性ACD模型的基礎上，局部外涂Art進行干預，通過檢測Treg、Th17細胞特異性核轉錄因子、相關細胞因子以及信號分子，探索Art對ACD小鼠Treg/Th17免疫平衡的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 Art(純度99.5%)購于鄭州荔諾生物科技發展有限公司;DNFB購于Sigma公司;TRIzol試劑購于Invitrogen公司;逆轉錄試劑盒購于Promega公司;小鼠Treg試劑盒購于eBioscience公司;STAT3及其磷酸化抗體phospho-STAT3(Ser727)購于Bioworld公司;Bradford蛋白濃度測定試劑盒、增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購于Pierce公司;IL-6、IL-10、IL-17的ELISA試劑盒購于R＆D公司;ICR小鼠(6～8周齡，♀)購于北京軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證SCXK-(軍)2007-004。

1.2 動物模型的建立及給藥方法 參照文獻方法［3］建立ACD小鼠模型:實驗前1日將每鼠腹部去毛，去毛范圍約為3 cm×3 cm。開始日(d 0)和d 1每日于去毛部位涂0.5%DNFB(以4∶1丙酮橄欖油配制)40 μl分別致敏1次。d 6于左耳內外側涂0.3%DNFB 20 μl激發。誘發前0.5 h和誘發后6 h小鼠左耳外涂Art乳膏(本室自制，Art濃度分別為2%、4%、8%)。激發后48 h處死小鼠。取一組模型小鼠外涂乳膏基質作為基質對照以排除基質對ACD的影響。

1.3 RT-RCR 檢測 Foxp3、ROR-γt的 mRNA 表達

收集各組小鼠引流淋巴結，提取組織RNA，檢測A260/A280比值在1.8～2.0。引物序列由金思特科技有限公司合成如下:Foxp3(424 bp):上游引物5'-ACGCCCCAACAAGTGCTCCA-3'，下游引物 5'-TGGCAGTGGCCAAGGCAGAT-3';ROR-γt(291 bp):上游引物5'-TGAACTTGGGGAACCAGAAC-3'，下游引物5'-TTGGCAAACTCCACCACATA-3';GAPDH(225 bp):上游引物5'-TGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物 5'-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3'。按照Promega公司逆轉錄試劑盒說明進行cDNA合成。PCR擴增條件為:預變性94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 30 s，共 34 個循環。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，應用Gel-Doc2000凝膠成像分析系統測定各組條帶。

1.4 雙抗體夾心ELISA檢測IL-6、IL-10、IL-17含量 收集模型及給藥干預各組小鼠耳組織，置于含0.1%Tween 20的PBS中勻漿，取上清，按試劑盒推薦的步驟，用雙抗體夾心ELISA法檢測細胞因子含量。

1.5 流式細胞術 按文獻方法［4］收集、純化各組小鼠淋巴結 T細胞，以 staining buffer洗滌 3次(2 000 r·min－1，5 min/次)，根據試劑盒推薦的步驟，以抗-CD4和抗-CD25抗體進行表面標記，4℃避光孵育30 min，洗滌3次，固定、破膜后加入抗Foxp3及相應的同型對照，4℃，避光孵育30 min，洗滌后以staining buffer重懸細胞，Backmen流式細胞儀上機分析。FITC為熒光1通道(FL1)，PE為熒光2通道(FL2)，PE-Cy5為熒光4通道(FL4)，采用SystemⅡTM軟件進行數據分析。

1.6 Western blot檢測STAT3的活性表達 收集各組小鼠淋巴結，提取組織蛋白，Bradford法定量蛋白含量，SDS-PAGE電泳，半干法轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(Phospho-STAT3，1∶1 000)孵育，4℃過夜，TBST洗膜后以辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL法檢測。用Stripping Solution洗脫、封閉后，再次加入一抗(STAT3，1∶1 000)、二抗，顯影。采用 BioRad系統進行數據分析。

2 結果

2.1 Art調節Treg/Th17細胞特異性核因子的基因表達 Foxp3與ROR-γt分別是Treg細胞和Th17細胞的特異性標志和特異性轉錄因子，在相應T細胞亞群的分化過程中起重要作用［5］。為探討Art對Treg/Th17免疫平衡的調節作用，采用RT-PCR檢測Foxp3和ROR-γt的基因表達。Art作用后，Foxp3的mRNA表達增加，尤以中、高劑量組明顯;同時ROR-γt的mRNA表達明顯下降(Fig 1)。可見，在DNFB誘導的ACD小鼠中，Art能夠通過影響Foxp3和ROR-γt基因表達抑制Th17細胞分化、誘導Treg生成，從而調節Treg/Th17免疫平衡。

Fig 1 Effect of artemisinin(Art)on the expression of Foxp3 and ROR-γt1:Marker;2:Normal;3:Vehicle;4:2%Art;5:4%Art;6:8%Art.Art:artemisinin;Normal:normal mice;Vehicle:vehicle group without Art.

2.2 Art對Treg/Th17細胞相關細胞因子產生的影響 ELISA檢測結果顯示(Fig 2)，與正常組比較，基質對照組IL-17含量明顯增高，而IL-10則明顯降低(P＜0.05)。Art作用后，Treg/Th17相關細胞因子的產生顯示出不同程度的變化，與基質對照相比，Art能有效抑制IL-17的產生，且呈一定的劑量依賴性，然而 Art對 IL-10產生無影響(P＞0.05)。

2.3 Art對CD4+CD25+Foxp3+Treg亞群的調節作用 流式細胞儀檢測結果可見(Fig 3)，高劑量Art作用后，CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞約占6.14%，與基質對照組(5.08%)相比明顯升高，但中、低劑量Art則下調Treg的產生(P＜0.05)，提示高劑量Art對CD4+CD25+Foxp3+Treg亞群有促增殖效應，而中、低劑量的 Art則抑制 CD4+CD25+Foxp3+Treg的增殖分化。

2.4 Art抑制IL-6及Phospho-STAT3的活性表達

炎癥部位IL-6含量的檢測結果顯示，高劑量Art明顯抑制ACD小鼠的IL-6產生，中、低劑量組的差異無顯著性(P＞0.05)。Western檢測結果表明，Art能有效減弱p-STAT3的活性表達，同時不影響相應的非磷酸化抗體的蛋白表達(Fig 4)。

Fig 2 Effect of Art on IL-10 and IL-17A:The production of IL-17;B:The production of IL-10.＊＊P＜0.01 vs vehicle group

3 討論

ACD的病理過程主要為T細胞介導的遲發型超敏反應。傳統上根據分化和功能特征可將CD4+T細胞分為Th1和Th2細胞，正常情況下Th1/Th2免疫應答處于動態平衡，一旦該模式向Th1偏移時會發生炎癥反應和組織損傷，ACD一度被認為與Thl型免疫反應相關。目前對ACD的發病機制仍存在不少爭議，有研究發現下調Th1應答能夠治療ACD，但也有報道指出，可以通過糾正Th2偏移控制ACD［6－7］。最近研究表明，ACD 的細胞因子反應模式與過敏原類型、接觸途徑等因素有關，如在DNFB誘導的ACD中T細胞向Th1分化偏移，而異硫氰酸熒光素(FITC)誘導的ACD中T細胞則向Th2偏移［6］，因此ACD的發病過程可能同時涉及 Th1和Th2細胞，兩者在疾病發展的不同階段可能呈交互出現。

Fig 3 Effect of Art on the generation of Treg

以往研究報道，無論DNFB還是FITC誘導的ACD動物模型，CD4+T細胞都能降低ACD發生，然而對CD4+T細胞減弱過敏原引發炎癥的原因尚不清楚，直到Sakaguchi等［8］發現和提出調節性 T細胞(regulatory T cell，Treg)的存在。現已明確，過激的免疫應答(如遲發型超敏反應)不僅有效應性T細胞活化，還伴隨著Treg的形成，Treg和效應細胞之間的平衡是免疫系統控制免疫應答的關鍵，Treg功能低下甚至可以成為導致ACD發生的重要原因［9］。新近證實，抗炎劑可通過誘導Treg明顯減輕小鼠的接觸性超敏反應［10］。本課題組前期發現，Art不但對DNFB誘導的ACD小鼠耳腫脹有明顯抑制效應，而且能夠劑量依賴性地促進 TGF-β產生［11］。本實驗進一步觀察Art對Treg細胞的影響，發現Art能劑量依賴性地上調ACD小鼠的Foxp3表達。已有文獻報道表明，較低劑量的Art能夠增強小鼠T細胞介導的免疫應答，對免疫功能重建起到一定作用［12］;而高劑量Art則具有廣泛的免疫抑制作用［13］。本研究結果提示，高劑量Art可以通過誘導Treg發揮免疫抑制作用，而較低劑量的Art則抑制Treg的產生，與文獻報道相一致。可見，Art的這種雙相免疫調節效應或許與藥物劑量、給藥途徑以及機體狀態等多種因素有關。

Fig 4 Inhibitory effect of Art on IL-6 level and phosphorylated-STAT3 expressionA:The production of IL-6;B:The expression of phosphorylated-STAT3.＊＊P ＜0.01 versus vehicle group.1:Normal;2:Vehicle;3:2%Art;4:4%Art;5:8%Art

Th17細胞是人們新近發現的以IL-17為主要效應因子的新型CD4+T細胞亞群，參與機體多種炎癥和免疫性疾病的發生［14］。有報道指出，ACD患者皮損部位可見大量Th17細胞浸潤、IL-17表達增加［5］。Th17的發現彌補了Th1/Th2介導ACD免疫效應機制的不足。IL-6是重要促炎因子，一般認為，IL-6和TGF-β是誘導初始CD4+T細胞向Th17細胞分化的關鍵細胞因子，兩者同時存在時，會促進Th17細胞生成的正反饋環路，使初始T細胞向Th17細胞分化并產生 IL-17，后者進一步促進 IL-6的產生［15］。參與IL-17產生的一個重要的信號分子是信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)，能被IL-6經由細胞膜受體gpl30/II-6Ra活化，進而與酪氨酸磷酸化信號通路偶聯，發揮轉錄調控作用［16］。本實驗及課題組前期研究結果顯示［11］，Art明顯抑制ACD小鼠高表達的 ROR-γt及 IL-17 的產生，上調 TGF-β，從而進一步促進Treg細胞的生成。另一方面，Art還能抑制IL-6水平及STAT3的活性表達，隨著IL-6的降低，增加的TGF-β又能通過擴增、維持Treg細胞，將效應細胞的功能維持在合適狀態，從而有效控制ACD的發病過程。

以往認為，ACD的免疫學發病機制主要是Th1細胞占優勢的免疫應答，Th17細胞的發現拓寬了對ACD形成機制的認識，有助于解釋Th1/Th2軸中異常現象發生的原因。Th17在分化和功能上能夠與Treg相互轉化，TGF-β可誘導初始 T細胞分化為Treg并抑制免疫應答;而在IL-6存在情況下，TGF-β則促進Th17細胞生成并分泌IL-17，促進炎癥反應發生。可見，Th1/Th2細胞、Treg/Th17細胞及其相關細胞因子間免疫平衡的破壞對ACD的發生、發展具有重要作用，調控Treg/Th17之間的平衡，可能為有效治療ACD提供一個新的途徑。

總之，本研究顯示Art具有良好的免疫抑制活性，對DNFB誘導的小鼠ACD具有保護作用，推測低濃度的TGF-β和IL-6的協同作用能誘導Th17細胞特異性核轉錄因子ROR-γt產生，增加Th17細胞數量;而高濃度TGF-β則上調Foxp3表達，影響IL-17產生進而抑制Th17細胞分化。據此認為，在DNFB誘導的ACD中，IL-6的明顯增多使初始T細胞向Th17細胞分化，Art通過下調炎癥組織中的IL-6、IL-17，抑制 ROR-γt表達，上調 TGF-β 與 Foxp3，從而抑制Th17細胞產生;另一方面，當Art干預后，TGF-β水平升高，IL-6水平降低，增高的 TGF-β可促使 Treg細胞增多、抑制 Th17細胞分化。同時Treg細胞還可抑制Th17細胞及IL-17的活性，使炎癥反應減輕。此外，在Art阻止IL-6誘導Th17細胞并促進抗炎性Treg的分化中，其對STAT3信號途徑的阻斷似乎是關鍵因素，然而STAT3能否成為Art治療ACD的有效靶位尚需進一步研究。

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