AG490對人宮頸癌裸鼠移植瘤STAT3信號轉導通路的影響

馬 戎，魯 琰，王海琳，葉云飛

(1.西北民族大學醫學院，甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省婦幼保健院，甘肅蘭州 730050;3.甘肅省人民醫院婦產科，甘肅蘭州 730000;4.廣西柳州市人民醫院婦產科，廣西柳州 545006)

信號轉導和轉錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)是JAK激酶/信號傳導和轉錄激活因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transeription，JAKs/STATs)信號轉導通路的重要成員，近年來研究提示STAT3在人類多種腫瘤組織與細胞系中異常表達或活性增強［1-2］。在本實驗中，利用AG490來抑制JAK酶活性，并聯合順鉑觀察JAK酶被抑制后宮頸癌裸鼠移植瘤內STAT3活化情況的變化和Survivin、Caspase-3表達的改變以及裸鼠移植瘤生長凋亡的變化。

1 材料與方法

1.1宮頸癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立Balb/c-nu♀裸小鼠35只，人宮頸癌HeLa細胞株配制成2×1010·L-1單細胞懸液，于裸鼠背側近右后肢皮下接種0.2 ml，約30 d后明顯成瘤。

1.2實驗分組將裸鼠稱重后用隨機數字表法分成4組，每組8只(去除瘤體最小的裸鼠3只)，藥物濃度及具體分組如下:① 對照組:0.2 ml生理鹽水;② 順鉑組:5 mg·kg-1;③ AG490組:8 mg·kg-1;④ AG490+DDP組:8 mg·kg-1+5 mg·kg-1。上述藥物均為一次腹腔注射0.2 ml，每3天1次，共注射4次。停藥后處死裸鼠，測量腫瘤重量，計算抑瘤率。

1.3流式細胞術分析檢測各組凋亡率。

1.4病理組織學觀察及免疫組織化學染色法檢測PSTAT3、Survivin和Caspase-3的表達移植瘤組織按常規HE染色，計算腫瘤細胞平均壞死率。

1.5Western blot檢測腫瘤組織中P-STAT3、Survivin和Caspase-3表達

1.6統計學處理兩兩比較用 Student’st檢驗。免疫組化結果用χ2檢驗及非參數spearman等級相關檢驗。

2 結果

2.1抗腫瘤作用的的比較DDP組抑瘤率51.20%;AG490組抑瘤率33.59%;DDP+AG490組抑瘤率59.18%，DDP聯合AG490組的抗腫瘤作用明顯強于其他組(P＜0.01)。

2.2體內實驗毒副作用觀察治療后4組裸鼠體重的變化見Tab 1。

Tab 1 Weight of nude mice(±s，n=8)

Tab 1 Weight of nude mice(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Different time periods weight of nude mice in each group/g d 1 d 4 d 7 d 10 Control 20.29±1.28 20.88±0.76 21.52±0.72 22.21±0.77 DDP 20.29±1.25 19.95±1.35 17.76±0.93＊＊17.03±1.04＊＊AG490 20.33±1.66 20.96±1.66 21.59±1.76 21.19±1.94 DDP+AG490 20.06±1.44 19.5±0.98 18.78±0.95 18.6±0.93

2.3AG490與DDP可促進凋亡凋亡率分別是(52.1±1.3)%、(39.5±0.4)%、(66.7±1.8)%，各組與對照組(10.2±2.4)%相比差異均有顯著性(P＜0.05)。

2.4病理結果腫瘤細胞平均壞死率為:對照組(21.8±9.0)%、AG490組(39.4±11.3)%、DDP組(40.8±7.3)%、DDP+AG490組(61.9±9.6)%(P＜0.05)。

2.5免疫組化結果顯示P-STAT3、Survivin和Caspase-3均定位胞質，各組陽性細胞占總細胞數依次為:P-STAT3:對照組0.93，DDP 組0.64，AG490組0.55，DDP+AG490組0.41;Survivin:對照組 0.90，DDP 組 0.54，AG490 組 0.52，DDP+AG490組0.37;Caspase-3:對照組0.30，DDP組0.60，AG490組0.59，DDP+AG490組0.92;可見在對照組中 P-STAT3、Survivin均為高表達，用藥后表達有下降，而Caspase-3恰好相反(P＜0.05)。

2.6Western blot結果P-STAT3、Survivin 的表達在對照組最高，DDP+AG490組明顯降低，DDP組、AG490組也有降低，Caspase-3蛋白的表達正好相反，對照組最低，DDP+AG490組明顯升高。

3 討論

AG490(tyrphosin490)是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，結構類似酪氨酸，具有抗腫瘤的作用［3］。本實驗將AG490和DDP單獨或聯合注射到裸鼠體內后移植瘤腫瘤生長均受到抑制，隨著時間的延長這種抑制作用更加明顯，從d7起AG490+DDP組對腫瘤的生長抑制作用明顯強于任一單藥組，產生明顯的協同作用，且治療結束AG490+DDP組抑瘤率、凋亡率明顯高于AG490組或DDP組(P＜0.05)，說明AG490與DDP聯合應用對宮頸癌的生長抑制作用較為理想，AG490可以增強DDP的藥物敏感性，并能減輕順鉑的藥物反應。免疫組化結果統計分析顯示P-STAT3與Caspase-3存在相關性，與 Survivin無相關性;Caspase-3與Survivin存在相關，說明在子宮頸癌裸鼠移植瘤中，JAKSTAT3信號通路與Caspase-3的表達之間可能存在直接的關系，與 Survivin之間可能存在間接的關系，與研究［4］發現Survivin為Caspase-3上游靶基因相符。對STAT3信號通路與Survivin、Caspase-3的表達之間的關系初步探討為:AG490通過阻斷STAT 3通路抑制P-STAT3的活化，從而減少Survivin蛋白的表達，由于Survivin蛋白被抑制，Caspase-3蛋白被激活，從而執行腫瘤細胞凋亡任務。因此，AG490可能是通過對Survivin基因的間接抑制，直接促進Caspase-3蛋白的合成，誘導腫瘤細胞凋亡。但子宮頸癌中P-STAT3對Survivin、Caspase-3的調控機制還需進一步研究。

［1］Groot R P，Raaijmakers J A，Lammers J W，et al.Dependent CyclinD1 and Bcl-xL expression in BCR ABL transformed cells［J］.Mol Cell Biol Res Commun，2000，3(5):299-305.

［2］牛麗穎，任艷青，王鑫國，等.淡豆豉異黃酮對增殖血管平滑肌細胞JAK2/STAT3信號轉導通路的影響［J］.中國藥理學通報，2009，11:1487-90.

［2］Niu L Y，Ren Y Q，Wang X G，et al.Effect of semen sojae preparatum isoflavone on JAK2/STAT3 signal transduction pathway in proliferated vascular smooth muscle cell［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，11:1487-90.

［3］劉青娟，邢玲玲，劉淑霞，等.抑瘤素M在腎小管上皮細胞轉分化中作用及AG490的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(12):1640-3.

［3］Liu Q J，Xing L L，Liu S X，et al，The effect of AG490 on oncostatin M induced tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(12):1640-3.

［4］Ueno N T，Bartholomeusz C，Herrmann J L，et al.E1A-mediated paclitaxel sensitization in HER-2-neu-over expressing ovarian cancer SKOV3.ipl through aportosis involving the Caspase-3 pathway［J］.Clini Cancer Res，2000，6:250-9.