右美托咪定對抗化學性低氧引起的PC12細胞損傷

莫利求，蘭愛平，林 琳，周 舸，張莉莉，楊春濤，王秀玉，楊戰利，陳培熹，馮鑒強，

目前，α2腎上腺素受體激動劑(alpha(α)-2-adrenoreceptor agonist)在麻醉及重癥監護治療中的作用日益受到重視。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種強效的，高度選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，對人的中樞神經系統具有多種作用，例如臨床鎮靜、輕度的麻醉及鎮痛作用等［1－2］。近年的實驗研究證明，DEX還有神經保護作用。在剝奪氧氣和葡萄糖(模擬缺血)的大鼠海馬腦片實驗模型，Dahmani等［3］觀察到，DEX能減少神經元死亡及凋亡效應器Caspase-3表達，此神經保護作用可能與激活α2腎上腺素受體，繼而促進灶性黏附激酶(focal adhesion kinase)的表達有關。然而，DEX能否保護神經細胞對抗化學性缺氧引起的損傷尚未見報道。為此，本文應用化學性低氧模擬劑氯化鈷(CoCl2)處理具有神經功能和結構特征的PC12細胞。以建立化學性低氧神經細胞損傷模型，旨在探討:①DEX能否抑制CoCl2的細胞毒性及致凋亡作用?②DEX能否抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成?③ DEX是否具有線粒體保護作用?通過上述研究為深入闡明DEX的神經保護作用及其機制提供新穎的實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料 DEX由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供。CoCl2，Hoechst33258，DCFH-DA，Rh123購自美國Sigma Aldrich公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Lab，DMEM高糖培養基購自Gibco公司。

1.2 細胞培養及預處理方法 PC12細胞由中山大學實驗動物中心提供，置于含10%新生牛血清的DMEM高糖培養基中，于37℃，5%CO2條件下培養，選取對數生長期細胞進行實驗。DEX處理按如下程序實施:400 μmol·L－1DEX 與 600 μmol·L－1CoCl2共同作用PC12細胞24 h。

1.3 細胞存活率的檢測 取對數生長期PC12細胞，以 1 ×107·L－1接種于 96 孔板，100 μl/孔。在37℃，5%CO2條件下常規培養過夜后，按實驗要求給予不同處理，每孔設8個平行孔，處理完后，每孔加入10 μl的 CCK-8，37℃繼續孵育 4 h，用酶標儀(450 nm)記錄各孔的吸光度(OD)。取4孔OD值的平均數，按公式計算細胞存活率。細胞存活率/%=處理組OD/對照組OD×100% ，重復3次。

1.4 Hoechst 33258核染色觀察凋亡細胞形態和數量 將PC12細胞(1×107·L－1)接種于35mm的小號培養皿中，各實驗組按要求給予不同的處理因素后，加入新鮮配置的4%多聚甲醛(pH=7.4)于4℃固定細胞10 min，用 PBS洗2次，加入5 mg·L－1Hoechst 33258染色液染色10 min，用 PBS洗2遍，加入適量的PBS后用熒光顯微鏡觀察，攝片。正常細胞核出現彌散均勻的低密度熒光;細胞核呈固縮形態或顆粒狀熒光，計為凋亡細胞。

1.5 細胞內ROS含量的測定 DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞后，可被細胞內的酯酶水解成DCFH，而DCFH不能自由通透細胞膜，從而將探針裝載到細胞內。細胞內的ROS可將無熒光的DCFH氧化成發出綠色熒光的DCF，綠色熒光的強弱可以間接反映細胞內ROS水平。將細胞接種于35 mm的培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，倒掉培養液，用無血清的低糖培養液洗兩次，隨后用10 μmol·L－1DCFH-DA 染液于37℃孵育60 min。在熒光顯微鏡下隨機選取不重復的區域攝片，用Image J 1.41.軟件的COLOR Hitogram模塊計算出5個視野綠色熒光強度的平均值，再對各組的樣本進行統計分析。

1.6 線粒體膜電位(MMP)的檢測 Rh123是一種能夠被線粒體所吸收的熒光染料，線粒體對其攝取能力取決于其跨膜電位。根據熒光強度可以間接反映MMP的高低，將細胞接種于35 mm的培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，倒掉培養液，用不含血清的低糖培養液洗兩次，隨后在含100 μg·L－1Rh123的無血清的培養基中37℃孵育45 min，在熒光顯微鏡下隨機選取不重復的區域攝片，細胞核周圍的綠色亮點即為攝取了Rh123的線粒體。用Image J 1.41.軟件的COLOR Hitogram模塊計算出5個視野綠色熒光強度的平均值，再對各組的樣本進行統計分析。

1.7 統計學處理 全部實驗數據經SPSS 13.0軟件進行統計學分析，所有結果以±s表示，組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗，用LSD進行均數之間的比較。

2 結果

2.1 DEX抑制CoCl2誘導的細胞毒性 Fig 1結果顯示，600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細胞 24 h后，使細胞存活率降低至 39.9% ±2.2%(P＜0.01)，提示CoCl2能產生細胞毒性作用。在600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12細胞的同時，應用100～600 μmol·L－1DEX 作用于細胞能明顯的抑制CoCl2的細胞毒性，其中400 μmol·L－1DEX 使細胞存活率升高至(59.3±2.1)%，與CoCl2處理組比較，具有統計學意義(P ＜ 0.01)，400 μmol·L－1DEX本身對細胞存活率無影響。

Fig 1 Effect of dexmedetomidine on cytotoxicity induced by CoCl2＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs CoCl2 group;dexmedetomidine:DEX

Fig 2 CoCl2-induced apoptosis in PC12 cells inhibited by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜ 0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.Bar=20 μm.

2.2 DEX抑制CoCl2的致細胞凋亡作用 Fig 2顯示 Hoechst33258核染色法檢測結果，600 μmol·L－1CoCl2處理PC12細胞48h后，使凋亡細胞數目明顯增多，凋亡率達36% ±1.2%。在600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12細胞的同時，應用400 μmol·L－1DEX抑制CoCl2誘導的細胞凋亡作用，使凋亡細胞數目減少，凋亡率降低到22% ±2.2%。400 μmol·L－1DEX本身不引起細胞凋亡。

2.3 DEX抑制CoCl2誘導的ROS過度生成 Fig 3 結果顯示，600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細胞6h后，使細胞內ROS水平比正常對照組高2.8倍(MFI為 24.7 ±1.4)(P ＜0.01)。在 600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細胞同時，應用400 μmol·L－1DEX作用于細胞能抑制CoCl2促進ROS生成作用，使 MFI降低至 15.5 ±2.2(P ＜0.01)。400 μmol·L－1DEX本身對細胞內ROS水平無影響。

Fig 3 CoCl2-induced overproduction of ROS in PC12 cells reduced by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.Bar=20 μm.

2.4 DEX抑制CoCl2對線粒體膜電位的損傷作用Fig 4 結果顯示，600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12細胞24h后，使細胞內的平均熒光強度(MFI，反映MMP大小的指標)從47.2±2.7(對照組)降到18.5±2.2(P＜0.01)，提示 CoCl2能損傷線粒體，使MMP 降低。然而，在 600 μmol·L－1CoCl2處理PC12細胞同時，應用 400 μmol·L－1DEX 作用細胞，能阻斷CoCl2降低 MMP的作用，MFI升高至34.5±2.1(P＜0.01)。

Fig 4 Inhibitory effect of CoCl2on MMP in PC12 cells block by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜ 0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.DEX，Bar=10 μm.

3 討論

CoCl2是一種化學性低氧模擬劑，在不同的細胞能模擬低氧/缺氧性損傷，表現為促進活性氧(ROS)生成［4－5］，降低線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)［4，6］，并引起細胞毒性和細胞凋亡［4－7］。因此，本文應用 CoCl2處理具有神經元結構和功能特征的PC12細胞，以探討α2腎上腺素受體激動劑DEX能否保護PC12細胞對抗化學性低氧引起的損傷。

本文證實，在 100 ～ 600 μmol·L－1濃度范圍內，DEX能濃度依賴性地抑制CoCl2引起的細胞毒性，使PC12細胞存活率明顯提高。同時，我們也注意到 50 μmol·L－1或 800 μmol·L－1DEX 雖然也能提高PC12細胞的存活率，但與對照組比較，差異不具有統計學意義(P＞0.05)，這提示DEX的抗細胞毒性作用存在一定濃度范圍，濃度偏低或過高可能會影響其細胞保護作用，其有關機制尚需進一步的研究。另一方面，DEX也能抑制CoCl2的致細胞凋亡作用，使細胞凋亡數量減少。上述結果提示，DEX能保護神經細胞對抗化學性低氧引起的損傷。最近Jean等［8］報道，應用DEX預處理或后處理(postconditioning)小鼠海馬腦片后能保護海馬神經元對抗缺血損傷，這與本文的結果相吻合，并提示DEX可在不同的缺氧或缺血細胞實驗模型中發揮其神經保護作用。

為了進一步探討DEX保護PC12細胞對抗化學性低氧引起的損傷的作用機制，本文觀察了DEX對CoCl2誘導的ROS過度生成的作用。ROS(包括超氧陰離子、H2O2等)被認為是缺氧/缺血性損傷的一個重要因素。ROS可快速地影響膜脂質、酶及其它重要的細胞成分，從而導致細胞死亡。ROS也可通過線粒體-ATP敏感性鉀通道及線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)等途徑損傷線粒體功能［9］。本文證實，DEX能明顯的抑制CoCl2誘導的ROS過度生成，提示DEX具有抗氧化應激作用，抑制ROS過度生成可能是DEX的神經保護機制之一。本實驗組在另一實驗中應用ROS抑制劑NAC后也能抑制CoCl2誘導的損傷，進一步證實了這一推斷。

本文還觀察到 DEX能明顯地對抗 CoCl2對MMP的損傷作用，使MMP丟失減小。MMP的穩定是產生ATP及維持細胞內穩態所必需的，是影響細胞生存的一個重要因素［10］。因此，本文推測，對抗CoCl2對MMP的降低作用可能是DEX另一神經保護機制。

［1］Jalowiecki P，Rundner R，Gonciarz M，et al.Sole use of dexmedetomidine has limited utility for conscious sedation during outpatientcolonoscopy［J］.Anesthesiology，2005，103:269 －73.

［2］Walker S M，Howard R F，Keay K A，et al.Developmental age influences the effect of epidural dexmedetomidine on inflammatory hyperalgesia in rat pups［J］.Anesthesiology，2005，102(6):1226－34.

［3］Dahmani S，Rouelle D，Gressens P，Mantz J.Effects of dexmedetomidine on hippocampal focal adhesion kinase tyrosine phosphorylation in physiologic and ischemic conditions［J］.Anesthesiology，2005，103(5):969 －77.

［4］孟金蘭，蘭愛平，楊春濤，等.熱休克蛋白90在硫化氫保護PC12細胞對抗化學性缺氧損傷中的作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(1):103 －7.

［4］Meng J L，Lan A P，Yang C T，et al.Role of heat shock protein 90 in protective effect of hydrogen sulfide against PC12 cells injuries induced by chemical hypoxia［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):103－7.

［5］Jung J Y，Mo H C，Yang K H，et al.Inhibition by epigallocatechin gallate of CoCl2-induced apoptosis in rat PC12 cells［J］.Life Sci，2007，80(15):1355 －63.

［6］蘭愛平，梅衛義，孟金蘭，等.硫化氫通過抑制p38 MAPK保護PC12細胞對抗化學性缺氧損傷［J］.中國藥理學通報，2010，26(10):1339－43.

［6］Lan A P，Mei W Y，Meng J L，et al.Hydrogen sulfide protects PC12 cells against chemical hypoxia-induced injury by inhibing p38MAPK［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(10):1339 － 43.

［7］Zou W，Yan M，Xu W，et al.Cobalt chloride induces PC12 cells apoptosis through reactive oxygen species and accompanied by AP-1 activation［J］.J Neurosci Res，2001，64:646 －53.

［8］Dahmani S，Rouelle D，Gressens P，et al.Characterization of the postconditioning effect of dexmedetomidine in mouse organotypic hippocampal slice cultures exposed to oxygen and glucose deprivation［J］.Anesthesiology，2010，112:373 －83.

［9］Crompton M.The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death［J］.Biochem J，1999，341:233 －49.

［10］Akao M，O’Rourke B，Teshima Y，et al，Mechanistically distinct steps in the mitochondrial death pathway triggered by oxidative stress in cardiac myocytes［J］.Circ Res，2003，92:186 －94.