融合蛋白GGH在小鼠體內的藥效學評價

范 翰，李現麗，竇文芳，杜 斌，邱麗穎，金 堅，許正宏

(江南大學醫(yī)藥學院，江蘇 無錫 214122)

近年來糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其無法根治的原因是缺乏有效修復β細胞功能的藥物，GLP-1因能促胰島素釋放和促胰島細胞增殖而成為該領域的研究熱點。但是GLP-1在體內的半衰期極短，目前研究主要集中在以GLP-1為基礎的分子衍生物［1-2］上，現已有部分長效藥物被批準用于臨床［3-4］。該研究前期利用分子生物學手段，將GLP-1突變體GLP-1A2G兩分子串聯后和人血清白蛋白(HSA)融合構建長效融合蛋白GGH［5］，并對其進行分離純化［6-7］。后期篩選和建立了一種β細胞輕度損傷模型，用于GGH及近年來新興的促β細胞增生類融合蛋白藥物療效的快速篩選、評價及作用機制的初步探討。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器STZ，Sigma公司;GLP-1單體，上海強耀生物工程公司;HSA，湖南紫光古漢南越制藥有限公司;Ex-4，Sigma公司;融合蛋白GGH，江南大學制藥工程實驗室(HPLC檢測純度＞95%);碘［125I］胰島素放射免疫分析藥盒，北京市福瑞生物工程公司;小鼠增殖細胞核抗原(PCNA)抗體，鏈霉親和素-過氧化物酶(SABC)及DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。Freestyle血糖儀及檢測試紙條，美國雅培有限公司;冷凍離心機，日本Hitachi公司;Wizard 1470γ自動計數儀，美國Perkin Elmer儀器公司;切片機，德國特萊富公司。

1.2β細胞輕度損傷模型的建立健康♂C57BL/6小鼠16只，16～18 g，SPF級，由中國科學院上海實驗動物中心提供〔SCXK(滬)2007-0005〕。按體質量隨機分為NC組和STZ實驗組，每組8只，實驗前禁食14～16 h，次日尾靜脈取血測定FBG，實驗組單劑量腹腔注射STZ 120 mg·kg-1，之后每周測定FBG，實驗觀察期為5周，實驗結束后摘取胰腺制備石蠟切片行HE染色。d 14的FBG在10～20 mmol·L-1且實驗結束時恢復到正常水平的為成功β細胞輕度損傷模型，“成模率/%=成模小鼠只數/造模小鼠只數”，“恢復率/%=血糖恢復的小鼠只數/成模小鼠只數”。

1.3融合蛋白GGH的降糖藥效評價另70只C57BL/6小鼠腹腔注射STZ造模，14 d后將56只成模小鼠納入統計范圍，按FBG分為7組，每組8只:模型對照組(DM)、GLP-1對照組(0.07 mg·kg-1)、HSA對照組(2 mg·kg-1)、Ex-4 陽性對照組(0.1 mg·kg-1)、GGH 低、中、高劑量組(2、6、18 mg·kg-1，GGH 2、GGH 6、GGH 18)，并設 NC 組。每天1次皮下注射，連續(xù)治療2周。每周1次禁食12 h測定FBG;實驗結束前1天小鼠進入代謝籠，記錄飲食、飲水、尿量和體重變化數值;實驗結束后，小鼠眼眶靜脈叢取血，收集血清樣本，測定血清胰島素水平;對胰島細胞做PCNA免疫組化，每張切片上、下、中、左、右處各選取1個胰島，共5個胰島，在400倍視野中計數陽性細胞，取平均值。

1.4統計學處理所有實驗數據均以±s表示，用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理，兩組比較采用t檢驗。

2 結果

2.1β細胞輕度損傷模型的建立STZ組d 14時成模率為88%，d 35時血糖均值與NC組比較差異無顯著性，恢復率為86%，見Fig 1。胰島HE染色，見Fig 2。d 14時NC組:胰島結構清晰，邊緣清楚，細胞排列整齊，胞質豐富;STZ組:胰島結構較清晰，邊緣模糊，細胞分布較不均勻，細胞數目略有減少，說明給予STZ后引起了胰島結構的輕度損傷，d 35時STZ組胰島自我修復較好，形態(tài)與NC組接近。故單劑量給藥STZ 120 mg·kg-1時C57BL/6小鼠成模率高，恢復率好，為下一步研究融合蛋白GGH降糖效果的理想模型。

2.2融合蛋白GGH的降糖藥效評價

2.2.1GGH對C57BL/6模型小鼠飲食、飲水、尿量和體重的影響見Tab 1。GGH低劑量組d 14時與DM、GLP-1、HSA組比較飲食量、飲水量減少(P均＜0.05)，GGH中、高劑量組飲食量、飲水量和尿量減少(P均＜0.05)，GGH高劑量組飲食量、飲水量和尿量與Ex-4組比較差異無顯著性(P均＞0.05);GGH各治療組體質量d 14時與3組對照比較差異均無顯著性(這可能與C57BL/6小鼠的體重增長緩慢有關)，與NC組比較均降低(P均＜0.05)。表明GGH在治療期內對模型小鼠的“三多一少”癥狀有明顯改善，然而恢復到正常水平可能仍需要更長的時間。

Fig 1 Effect of STZ single administration on FBG level in C57BL/6 mice(±s，n=8)

Fig 2 Effect of STZ single administration on islet cells in C57BL/6 mice(HE×400)

Tab 1 Effect of GGH on diet，drinking water，urine volume and body weight in C57BL/6 models in two hours(±s，n=8)

Tab 1 Effect of GGH on diet，drinking water，urine volume and body weight in C57BL/6 models in two hours(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NC;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs DM，GLP-1，HSA;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ex-4

Group Diet/g·(10 g)-1 Drinking/ml·(10 g)-1 Urine/ml·(10 g)-1Weight/g NC 0.09±0.03 0.14±0.03 0.21±0.09 23.6±1.07 DM 0.48±0.06 1.67±0.20 1.38±0.17 22.0±1.24 GLP-1 0.47±0.04 1.75±0.31 1.30±0.17 22.2±0.88 HSA 0.49±0.05 1.70±0.28 1.25±0.14 21.2±1.47 Ex-4 0.39±0.10 0.69±0.13 0.45±0.12 22.1±0.57 GGH 2 0.40±0.08＊＊△# 1.37±0.36＊＊△## 1.08±0.34＊＊## 22.1±0.64＊＊GGH 6 0.37±0.12＊＊△ 1.25±0.39＊＊△## 0.99±0.20＊＊△△## 22.4±0.96*GGH 18 0.26±0.12＊＊△△ 0.73±0.15＊＊△△ 0.53±0.19＊＊△△ 22.3±0.94*

2.2.2GGH治療期內對C57BL/6模型小鼠FBG的影響d 7或d 14時，GGH中、高劑量組與DM、GLP-1、HSA組比較，可明顯降低血糖濃度(P均＜0.01)，GGH高劑量組與Ex-4組降糖效果比較差異無顯著性 (P均＞0.05)，d 14時GGH高劑量組與Ex-4組血糖濃度基本恢復到正常值范圍。表明GGH的降糖效果較好，高劑量組與陽性對照組接近。見Fig 3。

Fig 3Effect of GGH on FBG level of C57BL/6 model mice(±s，n=8)

2.2.3GGH治療14 d后對C57BL/6模型小鼠FINS的影響d 14時GGH中、高劑量組FINS水平較DM、GLP-1、HSA組明顯升高(P均＜0.05)，GGH高劑量組與NC組、Ex-4組比較差異無顯著性(P均＞0.05)。表明皮下注射GGH后可通過刺激胰島素分泌而降低血糖濃度。見Tab 2。

Tab 2 Effect of GGH on FINS and the proliferation of islet cells in C57BL/6 models(ˉx ± s，n=8 or 5)

2.2.4免疫組化染色增殖細胞核抗原(PCNA)與其特異性的抗體結合后呈現棕黃色顆粒，PCNA免疫染色基本完全著色于細胞核上，表現為彌散或顆粒形式或二者兼有，見Fig 4。NC組核內著色較淺，這是因為正常狀態(tài)下處于動態(tài)平衡中的β細胞更新較少［8］;GGH中、高劑量組核內棕黃色顆粒含量較豐富，著色較深，陽性細胞比例明顯高于NC、DM、GLP-1組(P均 ＜0.05，Tab 2);GGH 中、高劑量組與Ex-4組比較差異無顯著性(P＞0.05，Tab 2)。這一結果與 FBG、FINS一致，表明融合蛋白GGH可以通過促進β細胞的增殖和胰島素的分泌而降低模型小鼠的高血糖水平。

Fig 4 Effect of GGH on PCNA immunohistochemistry of islet cells in C57BL/6 models(SABC×400)

3 討論

GLP-1是一種生理性肽類腸道激素，它與胰島β細胞上特異性的受體(GLP-1R)結合后，能夠提高β細胞對葡萄糖的敏感性，刺激β細胞中葡萄糖依賴的胰島素分泌，而且動物實驗表明GLP-1可以促進胰島新生［9］。但是，機體本身產生的活性GLP-1極易被降解，為了提高GLP-1的生物活性，實現其在體內的長效作用，該研究前期利用白蛋白融合技術和基因工程手段，將GLP-1突變體GLP-1A2G兩分子串聯后和HSA進行融合表達胞外分泌融合蛋白GGH，初步藥代動力學顯示小鼠體內吸收半衰期為26.6 h，消除半衰期為 57.8 h［6］，克服了其易降解的缺點，然而是否保留天然GLP-1的功效還有待于證實。

為快速評價促β細胞增生類融合蛋白藥物的藥效及初步研究此類藥物的作用機制，參考糖尿病模型化學藥物的造模方法［10］，利用STZ輕度損傷小鼠胰島β細胞，使機體內早期(1～2周)胰島素分泌不足，血糖值持續(xù)穩(wěn)定升高(2～4周)，后期(4～5周)通過胰島功能的自我修復使血糖水平恢復正常，從而建立可逆β細胞損傷模型，這在其他文獻中尚未見報道。由于此模型小鼠的血糖濃度為一動態(tài)變化過程，因此選擇血糖水平維持較高的時段(2～4周)作為治療期，觀察GGH給藥后是否有更好的降糖效果或者是否縮短受損β細胞的修復時間，以此來評價GGH的降糖藥效。我們從2009年10月～2010年7月對小鼠進行β細胞輕度損傷造模篩選，結果發(fā)現♂C57BL/6小鼠單劑量腹腔注射STZ 120 mg·kg-114 d的成模率最高為88%，35 d的恢復率最好為86%，這為下一步研究融合蛋白GGH的降糖藥效提供了簡便理想的模型。

通過14 d治療發(fā)現，GGH治療組在飲食、飲水、尿量方面有明顯的減少;治療7 d時GGH高劑量組就已呈現明顯的降糖效果，治療期內與Ex-4組的血糖恢復速度接近，實驗結束時兩組的血糖恢復時間也明顯縮短于3組對照組，這提示短期使用GGH可以達到控制高血糖癥狀的目的。通過對小鼠FINS的測定及胰島PCNA免疫組化的半定量表明GGH不僅能夠促進胰島素分泌而且能夠促進β細胞增殖，加速受損的β細胞恢復正常，而這正是傳統糖尿病治療藥物無法根治糖尿病的癥結所在，提示GGH在治療糖尿病方面有廣闊的發(fā)展前景。

綜上所述，我們認為融合蛋白GGH模擬激活GLP-1R途徑發(fā)揮作用，即通過改善胰島細胞功能，增加胰島素的表達分泌及促進胰島細胞增殖從而達到降低血糖的目的。由此，GGH在克服了GLP-1易降解缺點的同時保留了其天然功效，這不僅對Ⅱ型糖尿病，而且對Ⅰ型糖尿病也具有肯定的治療作用，相信不久的將來GGH將會成為新型糖尿病治療藥物中的一員。

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