香菇多糖對免疫抑制小鼠腸道派氏結T細胞的影響

江益平，馬方勵，周 聯，王 青，董 燕

(1.廣州中醫藥大學臨床藥理研究所免疫研究室;2.無限極(中國)有限公司，廣州廣東 510405)

早在1968年，日本科學家就利用熱水浸提法從香菇子實體中提取、分離、純化出6種胞外多糖，lentinan、LC-11、LC-12、LC-13、EC-11 和 EC-14，同時他們發現這6種多糖中lentinan和LC-11具有抗腫瘤的生物學活性［1］。經過對香菇多糖的構效關系的研究，人們發現具備β-(1→3)連接的葡聚糖主鏈同時連接β-(1→6)側鏈的香菇多糖均會表現明顯的生物學活性，且分子量越大，生物學活性越顯著［2］。香菇多糖的抗腫瘤活性被認為與其活化T細胞，促進白細胞介素產生，增強巨噬細胞吞噬功能等免疫調節作用密切相關，臨床也已經將其作為腫瘤治療的輔助藥物［3-4］。但是，有關香菇多糖對腸道黏膜免疫系統的免疫調節作用至今少見報道。本實驗首先從體重增長趨勢、胸腺指數、脾淋巴細胞增殖能力和DTH反應能力方面確定香菇多糖對環磷酰胺免疫抑制小鼠的系統免疫功能的影響。同時，在DTH模型基礎上，通過免疫抑制小鼠小腸派氏結數目以及派氏結中T淋巴細胞比例和活化情況觀察香菇多糖對環磷酰胺免疫抑制小鼠腸道派氏結T淋巴細胞的影響，以確定香菇多糖對腸道黏膜免疫系統的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1動物和藥物NIH小鼠，♂，6～8周齡，體質量18～22 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(粵)2006-0015。香菇多糖噴干粉由無限極(中國)有限公司提供，依照文獻描述的硫酸-苯酚法結合3，5-二硝基水楊酸比色定糖法檢測多糖的含量為 0.52［5］;環磷酰胺(Cyclophosp homide，CY)，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號H32020875。

1.2試劑、耗材和儀器2，4-二硝基氟苯(DNFB)為日本東京化成工業株式會社產品;RPMI 1640培養基，為Gibco產品;胎牛血清(FBS)，為PAA產品;美洲商陸(PMW)、刀豆蛋白 A(ConA)和MTT為Sigma產品;APC-anti-mouseCD3，PE-anti-mouse CD69，FITC-anti-mouse CD4，PE-anti-mouse CD8 為eBioscience產品。96孔平底培養板，美國Corning公司產品;其它試劑均為進口分析純或國產分析純試劑。多功能酶標儀，瑞士TECAN公司;電子分析天平，德國Sartorius產品，d=0.1 mg;流式細胞儀，美國BD公司;臺式冷凍高速離心機，美國Beckman產品。

1.3統計學處理實驗數據以±s表示，采用SPSS11.5統計學軟件進行數據處理，統計方法應用單因素方差分析。

1.4方法

1.4.1LNT對腸道黏膜免疫系統的影響

1.4.1.1動物分組、給藥和DTH模型建立 28只NIH小鼠按體重隨機分成4組，正常組、模型組、香菇多糖低劑組、香菇多糖高劑組，每組7只動物。其中香菇多糖低劑組每天灌胃香菇多糖0.4 mg·g-1體質量，香菇多糖高劑組每天灌胃香菇多糖0.8 mg·g-1體質量，正常組和模型組以純水代替。給藥d 4，模型組和給藥組腹腔注射環磷酰胺85 μg·g-1體質量，正常組用生理鹽水對照，給藥周期為7 d。

給藥的d 2，各組小鼠的背部脫毛劑脫毛1 cm×1 cm，在脫毛后的d 2，脫毛區用0.44 mol·L-1丙酮20 μl涂抹致敏小鼠。在給藥的d 7，各組小鼠的右耳用0.08 mol·L-1DNFB丙酮20 μl進行攻擊，左耳用丙酮做對照。

1.4.1.2派氏結淋巴細胞比例和活化檢測 攻擊30 h后，脫頸椎處死小鼠，打開腹腔取出全段小腸，計數小腸派氏結的個數。取出3～4個派氏結，置于盛有冷PBS的無菌培養皿中。常規方法制備淋巴細胞懸液，調整細胞數至1×1010·L-1，APC-antimouse CD3，FITC-anti-mouse CD4 和 PE-anti-mouse CD8流式抗體檢測T細胞比例和亞群變化;APC-anti-mouse CD3和PE-anti-mouse CD69流式抗體檢測T細胞活化情況。

1.4.2香菇多糖對整體免疫系統的影響

1.4.2.2DTH實驗 動物分組、給藥和DTH模型建立同上。在DNFB丙酮攻擊右耳廓30 h后，脫頸椎處死小鼠，剪下左右耳廓，打孔稱重，計算耳腫脹度。

2 結果

2.1香菇多糖對系統免疫功能的影響腹腔注射85 μg·g-1體重環磷酰胺可以減輕小鼠胸腺質量，抑制PWM刺激的小鼠脾臟淋巴細胞的體外增殖及其遲發型超敏反應能力(P＜0.01或P＜0.05)，說明此劑量的環磷酰胺可以有效抑制小鼠系統免疫的正常功能。

與免疫抑制模型比較，香菇多糖組的小鼠胸腺指數雖然沒有明顯恢復，但均表現有一定程度的回升趨勢。而香菇多糖對PWM刺激的小鼠脾淋巴細胞增殖和遲發型超敏反應能力有明顯改善作用(P＜0.01或P＜0.05)，并與劑量呈現正相關。說明香菇多糖對免疫抑制小鼠的整體免疫系統有正向調節作用。見Tab 1、2。

Tab 1 Effects of lentinan on thymus index of mice(±s，n=7)

Tab 1 Effects of lentinan on thymus index of mice(±s，n=7)

＊＊P＜0.01 vs normal

Group Thymus index Normal 35.76±6.09 Model 22.19±3.90＊＊LNT 400 mg·kg-1 25.54±2.72 LNT 800 mg·kg-125.45±5.22

Tab 2 Effects of lentinan on lymphocyte proliferation of spleen lymphocytes and delayed type hypersensitivity of mice(±s，n=7)

Tab 2 Effects of lentinan on lymphocyte proliferation of spleen lymphocytes and delayed type hypersensitivity of mice(±s，n=7)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model

Group Stimulation index Ear swelling/mg Normal 2.11±0.69 18.91±4.46 Model 1.14±0.25* 12.36±1.62＊＊LNT 400 mg·kg-1 1.59±0.26# 15.64±3.30 LNT 800 mg·kg-1 1.75±0.04## 17.63±4.66#

2.2香菇多糖對腸道黏膜免疫功能的影響腹腔注射85 μg·g-1環磷酰胺能明顯升高派氏結中CD3+T淋巴細胞的比例，降低T淋巴細胞的正常活化水平，說明此劑量的環磷酰胺可以有效抑制小鼠的腸道黏膜免疫系統功能(P＜0.01或P＜0.05)。見 Tab 3、Fig 1、2。

Tab 3 Effects of lentinan on the proportion and activation of T lymphocytes in PPs of DTH mice(±s，n=7)

Tab 3 Effects of lentinan on the proportion and activation of T lymphocytes in PPs of DTH mice(±s，n=7)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal;##P＜0.01 vs model

Group CD3+cells/% CD69+cells/%Normal 22.90±5.00 36.60±2.20 Model 56.66±7.99＊＊ 18.48±3.24*LNT 400 mg·kg-1 53.75±8.11 21.82±7.48 LNT 800 mg·kg-1 29.38±5.86## 33.58±9.47##

與免疫抑制模型比較，灌服香菇多糖的小鼠小腸派氏結中的CD3+T淋巴細胞的相對比例及其活化水平都表現出明顯的恢復趨勢，其中0.8 mg·g-1劑量組的小鼠派氏結T細胞比例和活化水平接近正常組(P＜0.01)。說明香菇多糖對免疫抑制小鼠的腸道黏膜免疫系統有正向調節作用。

3 討論

人和動物的腸黏膜面積巨大，約2倍于皮膚的面積，每時每刻都接觸大量的抗原，承擔著重要的免疫功能，它是機體抗感染的第一道防線，也是機體感染的主要部位之一［6-7］。微生物學與傳染病學家Montagne曾經說過“腸道內壁是人體最大的免疫器官”，由此可以看出腸道黏膜免疫系統在人體免疫系統中占據的重要地位。派氏結是存在于哺乳動物小腸段的集合淋巴小結，常沿腸系膜對側分布，其中富含胸腺源性T細胞和B細胞，是腸道黏膜免疫系統的免疫誘導部位［8］。PP結是刺激sIgA分泌和誘導細胞增殖活化抵御腸道內有害物質侵襲的主要部位，PP結的大小、數量及其中淋巴細胞數量和活性狀態等可以反映腸道黏膜局部的免疫狀態［9-10］。

Fig 1Effects of lentinan on percentage of T cells in PPs of DTH mice(±s，n=7)

Fig 2Effects of lentinan on activation of T cells in PPs of DTH mice(±s，n=7)

香菇多糖對系統免疫功能的影響已經得到很多研究的證實，本實驗中，通過PWM刺激小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖和小鼠遲發型超敏反應能力兩方面，并結合小鼠體重增長趨勢和胸腺指數觀察香菇多糖對系統免疫功能的影響。結果顯示，香菇多糖對環磷酰胺誘導的系統免疫抑制狀態有改善和恢復作用。在確立香菇多糖對系統免疫的正向調節作用基礎上，本實驗在DTH模型小鼠上，通過腸道派氏結通過體外DNFB致敏、攻擊，誘導機體產生強烈的細胞免疫應答，機體內的T淋巴細胞會因此而發生增殖活化等現象，以觀察香菇多糖對免疫抑制小鼠腸道派氏結中T細胞的影響。在DTH模型基礎上，前后PP結中T淋巴細胞比例、亞群及活化的變化情況，一方面可以觀察香菇多糖是否能夠增強機體淋巴細胞對外來抗原刺激敏感性，另一方面可以放大香菇多糖的免疫藥效作用，便于結果的檢測和統計分析。實驗結果表明，香菇多糖對環磷酰胺誘導的PP結T、B淋巴細胞比例失衡，T淋巴細胞活化水平降低等腸道黏膜免疫紊亂狀態有明顯改善作用，對腸道黏膜免疫系統的功能具有正向調節的作用。

有學者通過口服與注射兩種給藥途徑比較四君子復方總多糖對環磷酰胺免疫抑制小鼠溶血素生成和遲發型超敏反應的實驗發現，口服給藥途徑的效果優于注射給藥［11］。在本實驗中，口服方式給予香菇多糖，小鼠的腸道黏膜免疫和系統免疫的紊亂和抑制狀態均表現出相應改善，提示機體腸道黏膜免疫與系統免疫之間存在著某種聯系。作為系統免疫的一個重要組成部分，腸道黏膜免疫系統局部的免疫反應可以通過淋巴細胞循環和歸巢等機制影響到系統免疫，由此，腸道黏膜免疫系統很可能是香菇多糖發揮免疫藥效的首要部位。

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