脂多糖激活補體誘導內皮細胞釋放黏附分子和凋亡

沈良賢，李 敏，孫黔云，石京山

(1.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002;2.遵義醫(yī)學院，貴州遵義 563000;3.貴州省人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，貴州貴陽 550002)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的正常結構成分，臨床上又稱為內毒素。在嚴重創(chuàng)傷、感染等應激狀態(tài)下，大量內毒素釋放入血，從而啟動炎癥和損傷，導致內毒素血癥、全身炎癥反應綜合征、感染性休克和多器官功能障礙綜合征等病癥。LPS具有多種病理生理效應。有研究表明，LPS能夠激活補體［1-2］。補體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛參與機體防御反應以及免疫調節(jié)［3-4］，其過度激活在炎癥反應的初始階段起著啟動、放大和效應的作用，通過抑制補體能有效減輕組織損傷程度［5］。迄今，LPS影響內皮細胞形態(tài)功能的研究頗多，但LPS激活補體對內皮細胞的作用極少見報道。為進一步了解病理生理情況下LPS激活血清補體對內皮細胞的影響，加深對相關疾病機制的認識以及為補體抑制劑的篩選評價提供參考依據(jù)，本工作開展了LPS激活補體作用于內皮細胞的相關實驗研究。

1 材料與方法

1.1材料人微血管內皮細胞株HMEC由本實驗室傳代培養(yǎng);眼鏡蛇毒因子 (cobra venom factor，CVF)的制備、補體活性的測定參照文獻［6-7］;LPS(Esherichia coli O111:B4)、兔抗綿羊紅細胞抗體購自美國Sigma公司;SRB(Sulforhodamine B)是東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品;Caspase-3/7試劑盒購自美國Promega公司;人 P-selectin、E-selectin和 ICAM-1 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司;正常人血清(normal human serum，NHS)由本實驗室健康志愿者獻血制備而得;滅活人血清(inactivated normal human serum，INHS)由NHS經(jīng)56℃處理30 min而得;其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2儀器Nikon TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);Molecular Devices Spectra MAX-190連續(xù)波長酶標儀(美國MD公司);Forma 3111型 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司);GloMax發(fā)光檢測儀(美國Promega公司)。

1.3方法

1.3.1HMEC的培養(yǎng)HMEC用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞達到對數(shù)生長期進行實驗。

1.3.2LPS激活血清補體的作用

1.3.2.1LPS對經(jīng)典途徑的激活 將不同濃度的LPS、NHS 各 15 μl混合后于 37℃ 預孵 2 h;取 LPS(400 mg· L-1)與 NHS各15 μl混合后于37℃預孵不同時間，分別取10 μl孵育混合物加入90 μl的GGVB(葡萄糖巴比妥明膠緩沖液)，再加入100 μl致敏綿羊紅細胞(5 ×1011cells· L-1)，37℃孵育30 min后，加入1 ml冷生理鹽水終止反應，2 000 r·min-1離心10 min，取上清于412 nm測定吸光值。

1.3.2.2LPS對替代途徑的激活 將不同濃度的LPS、NHS 各24 μl混合后于 37°C 預孵 2 h;取 LPS(800 mg· L-1)與 NHS 各 24 μl混合后于 37°C 預孵不同時間，分別取40 μl孵育混合物加入60 μl的GVB(巴比妥明膠緩沖液)，再加入100 μl兔紅細胞(1.5 × 1011cells· L-1)，37°C 孵育 30 min 后，加入0.5 ml冷生理鹽水終止反應，2 000 r· min-1離心10 min，取上清于412 nm測定吸光值。

1.3.3LPS激活血清補體活化HMEC的條件將HMEC 以5 ×107cells· L-1接種于 96 孔板，90 μl/孔，培養(yǎng)48 h后加入孵育混合物(NHS體積分數(shù)為5%、10%，15%、20%、25% 和 30%)，37℃ 培養(yǎng)20 min;在另一組實驗中加入NHS體積分數(shù)為20%的孵育混合物，37℃分別培養(yǎng) 5、10、20、30、60 min。取細胞上清，2 000 r· min-1離心10 min，取上清液按試劑盒說明書測定P-selectin。

1.3.4LPS激活血清補體對HMEC表達黏附分子的影響將HMEC以5×107cells· L-1接種于96孔板，90 μl/孔，培養(yǎng)48 h后加入血清體積分數(shù)為20%的孵育混合物，37℃培養(yǎng)不同時間后，取細胞上清，2 000 r· min-1離心10 min，取上清液按試劑盒說明書測定 P-selectin、E-selectin和 ICAM-1。以CVF激活血清補體作為本實驗的平行對照。

1.3.5LPS激活血清補體誘導HMEC凋亡的情況HMEC以5×107cells· L-1接種于96孔板，90 μl/孔，培養(yǎng)48 h后加入血清體積分數(shù)為20%的孵育混合物，再培養(yǎng)24 h，按試劑盒說明書測Caspase-3/7活性。以CVF激活血清補體作為本實驗的平行對照。

1.3.6LPS激活血清補體對HMEC生長的影響將HMEC以5×107cells· L-1接種于96孔板，90 μl/孔，培養(yǎng)48 h后加入血清體積分數(shù)為20%的孵育混合物，37℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加質量分數(shù)為 10% 的 TCA 100 μl/孔，4℃ 固定 1 h，棄去，雙蒸水輕輕洗5次，加入體積分數(shù)為1%的醋酸配置的 4 g· L-1的 SRB，100 μl/孔，室溫染色15 min，棄去，用體積分數(shù)為1%的醋酸洗5次，晾干，加10 mmol· L-1Tris 溶液 150 μl/孔，溶解后于 570 nm波長處測定吸光值。以CVF激活血清補體作為本實驗的平行對照。

1.3.7統(tǒng)計學分析結果以±s表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1LPS激活血清補體的作用LPS在預孵條件下，能激活補體經(jīng)典途徑和替代途徑，這種激活具有劑量和時間依賴性(Fig 1)。在預孵2 h的條件下，對經(jīng)典途徑和替代途徑溶血的IC50分別為118.48、195.82 mg· L-1。

2.2LPS激活血清補體活化HMEC的情況LPS和NHS共同孵育后作用于HMEC，結果顯示，P-selectin瞬時釋放增加，呈現(xiàn)量效依賴性(Fig 2)。

2.3LPS激活血清補體對HMEC表達黏附分子的影響實驗中LPS和NHS孵育后作用HMEC，使P-selectin瞬時釋放增加，E-selectin、ICAM-1表達明顯上調(Fig 3)。

Fig 1Effect of LPS on complement activation(±s，n=3)

Fig 2 Effect of incubation mixture of LPS and NHS on inducing HMEC to release P-selectin(±s，n=3).

2.4LPS激活血清補體誘導HMEC凋亡的情況

與INHS和LPS+INHS比較〔凋亡信號分別為(269 125.30±51 949.59)RLU、(273 239.20±26 454.41)RLU〕，LPS激活血清補體可導致 HMEC Caspase-3/7的活性信號明顯增強［(368374.3±19187.67)RLU］(Fig 4)。值得注意的是，單獨的LPS可誘導Caspase-3/7信號明顯增強［(1538748±118721.20)RLU］。

2.5LPS激活血清補體對HMEC生長的影響在本實驗選擇的條件下，LPS激活血清補體后對內皮細胞的生長未產(chǎn)生明顯抑制，各組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(數(shù)據(jù)未列出)。

3 討論

脂多糖在敗血癥等一系列病癥的發(fā)生中起重要作用，通過識別特異性細胞受體激活體內多種效應細胞，釋放細胞因子、炎癥介質，產(chǎn)生一系列病理生理效應。本實驗結果顯示，LPS激活補體具有量效、時效性，其激活產(chǎn)物能影響內皮細胞的功能，刺激P-selectin、E-selectin、ICAM-1的表達和凋亡的發(fā)生。

本研究通過LPS激活血清補體的量效、時效關系，確定了LPS激活血清補體的劑量和作用時間，在此基礎上，通過測定血管內皮細胞活化重要指標P-selectin的釋放情況，最終確立了LPS激活補體活化內皮細胞的合適條件。

Fig 3 Effect of incubation mixture of LPS and NHS on inducing HMEC to release P-selectin，E-selectin and ICAM-1(±s，n=3)

Fig 4 Apoptosis of HMEC induced by incubation mixture of LPS and NHS(±s，n=3).*P＜0.05 vs INHS;#P＜0.05 vs LPS+INHS

本實驗顯示，LPS激活血清補體能引起HMEC活化，明顯表達P-selectin、E-selectin和ICAM-1。P-selectin和E-selectin是選擇素家族中的重要成員，P-selectin主要分布于內皮細胞和血小板，主要介導粒細胞和單核細胞在內皮細胞表面滾動和最初結合，啟動炎癥的早期反應［8］。E-selectin主要分布于活化的內皮細胞，具有促進白細胞與內皮細胞黏附，向炎癥部位游走的功能。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族中的成員之一，引起炎癥細胞牢固黏附并跨內皮移行至血管外，參與炎癥的發(fā)生發(fā)展［9］。上述情況提示LPS激活血清補體具有促進中性粒細胞向內皮細胞黏附、聚集、游出的作用，從而啟動、加重損傷部位的炎癥反應。在實驗中我們檢測到Caspase-3/7活化明顯增強的信號。Caspase家族在凋亡程序的啟動和執(zhí)行過程中，起著非常重要的作用，直接參與凋亡的早期啟動、凋亡信號傳遞及凋亡晚期事件。Caspase-3/7是凋亡晚期表達的關鍵酶，其一旦活化，凋亡的發(fā)生就不可逆轉。從實驗中可以看到，CVF激活補體出現(xiàn)了明顯的凋亡信號，說明補體激活確實能誘導凋亡，這與文獻報道一致［10］。LPS與NHS孵育組和對照組(LPS+INHS)相比，凋亡信號有明顯增強，說明LPS激活的補體明確誘導了凋亡。值得注意的是，單獨的LPS能誘導強烈凋亡，但通過比較LPS組與LPS+INHS組以及正常細胞對照組的實驗結果，表明血清幾乎可以完全抑制LPS自身所能誘導的凋亡。同時，也提示由LPS本身所誘導的這種凋亡在體內血液環(huán)境下不太可能發(fā)生。

本實驗采用能特異激活補體替代途徑的CVF作為平行對照，考察激活血清補體對HMEC的作用和影響。CVF是來源于眼鏡蛇毒的一種高效補體激活蛋白，在正常血清中可與B因子形成具有C3/C5轉化酶活性的CVFBb，導致補體替代途徑持續(xù)激活，產(chǎn)生大量C3a、C5a及攻膜復合物(membrane attack complex，MAC)。CVF作為一個常用的補體研究工具，激活補體與體內補體激活高度相似，可用于模擬機體在病理狀態(tài)下補體替代途徑的過度激活狀態(tài)。本實驗顯示，LPS激活血清補體作用于內皮細胞的效應與CVF激活血清補體類似，提示LPS激活血清補體也產(chǎn)生了C3a、C5a和MAC。

本研究通過LPS激活補體作用內皮細胞，模擬病理生理情況下體內LPS對靶細胞的作用情況，表明LPS激活補體能活化和損傷內皮細胞，明顯上調黏附分子表達，并誘導內皮細胞凋亡。本工作有助于加深對補體相關疾病機制的認識和理解，為相關臨床治療策略、新藥研究提供有益的思路和參考。

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