度洛西汀對大鼠胸主動脈環舒張功能的影響

郭芬芬，任俊杰，王 君，武冬梅，梁月琴，呂志杰

(山西醫科大學1.藥理學教研室，2.第一醫院，山西太原 030000)

度洛西汀(duloxetine，DLX)化學名稱為:(+)-(S)-氮-甲基-γ-(1-萘氧基)-2-噻吩丙胺鹽酸鹽，是5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)再攝取的雙重抑制劑，通過抑制5-HT和NE再攝取發揮抗抑郁作用［1］。DLX抑制5-HT和NE的再攝取能力強，且作用均衡，2004年上市至今已成為全美乃至世界臨床一線抗抑郁藥，其市場占有率高［2］。由于對5-HT和NE再攝取的雙重抑制作用，DLX對心血管系統的不良反應受到關注。國外報道，與安慰劑相比，DLX能明顯增加心率和收縮壓，Thase等［3］建議服用DLX治療抑郁癥時應該在用藥前和用藥的整個過程中密切測量血壓。目前，對于DLX引起這些心血管不良反應的機制未見報道。本實驗利用血管張力記錄系統，觀察DLX對大鼠胸主動脈舒張功能的影響并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物健康♂SD大鼠43只，體質量(250～300)g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2藥品與試劑度洛西汀(duloxetine)，上海中西醫制藥有限公司生產，批號100701，規格20 mg/片。賽庚啶(cyproheptadine)，上海復旦復華藥業有限公司，批號100503，規格2 mg/片。哌唑嗪(prazosin)，上海信誼藥廠有限公司，批號110101 R，規格 1 mg/片。去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)，上海禾豐制藥有限公司，批號090202，規格2 mg/1 ml。以上藥品臨用前均用生理鹽水配制至所需濃度。乙酰膽堿 (acetylcholine，ACh)、Gli、TEA、BaCl2和4-AP均購自 Sigma公司。NaCl、KCl等化學試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器BL-420F生物機能實驗系統購自成都泰盟科技有限公司;HSS-1B數字式超級恒溫浴鍋購自成都儀器廠;張力換能器(JH-2)購自高碑店市新航機電設備有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主動脈血管環的制備用鈍器擊昏大鼠，頸椎脫臼處死后，打開胸腔，分離胸主動脈，將取下的胸主動脈放入4℃的生理鹽溶液(PSS)(mmol·L-1:NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，CaCl22.5，葡萄糖11.1，HEPES 5，pH 7.38)中。去除血管周圍的脂肪及結締組織，將動脈剪成3～4 mm的小段。血管環用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，橫向懸掛在10 ml浴管內，下方固定，上方以一細鋼絲連于張力換能器，其靜息張力調節為2 g，使用BL-420F生物機能實驗系統記錄血管環張力變化。浴液為PSS液，浴槽中通以95%O2和5%CO2混合氣，37℃平衡1 h，每15 min換液1次。以KCl 60 mmol·L-1收縮動脈環3次，如果前后兩次最大收縮幅度差小于5%者，認為反應性可重復，方可用于正式實驗。

1.2.2去內皮血管環的制備將修剪干凈的胸主動脈環兩端固定，用與血管內徑相適的棉棒從管腔擦過，連續兩次。血管環懸掛穩定1 h后，用KCl 60 mmol·L-1刺激，達到坪值后，加入 ACh(10 μmol·L-1)。舒張幅度不超過收縮幅度5%時，認為內皮去除完全，可以開始實驗。

1.2.3DLX對KCl或NE預收縮內皮完整和去內皮大鼠主動脈環的影響內皮完整和去內皮的胸主動脈環，同時一次性加入KCl(30 mmol·L-1)或NE(1 μmol·L-1)，待血管環收縮達到穩定后，實驗組累積加入DLX使浴管中的終濃度依次遞增為(3、10、30 和 100 μmol·L-1)，對照組加入溶劑，觀察血管反應。各組以加入1 μmol·L-1NE或30 mmol·L-1KCl誘發的血管環的最大收縮幅度為100%，計算加入不同濃度DLX后最大舒張百分比變化，建立濃度-效應曲線，并與溶劑對照組比較。

1.2.4鉀離子通道阻斷劑對DLX舒張作用的影響觀察鉀離子通道阻斷劑對DLX舒張血管作用的影響時，主動脈環用KCl(30 mmol·L-1)預收縮，當血管收縮達到坪值后，實驗組分別加入 Gli(10 μmol·L-1)、TEA(10 mmol·L-1)、BaCl2(1 mmol·L-1)、4-AP(1 mmol·L-1)，對照組加入溶劑，待各組再次反應達到坪值后，實驗組和對照組分別累積加入 DLX(3 ～100 μmol·L-1)。

1.2.55-HT2受體阻斷劑賽庚啶和α1受體阻斷劑哌唑嗪對DLX舒張作用的影響觀察5-HT2受體阻斷劑賽庚啶和α1受體阻斷劑哌唑嗪對DLX舒張血管作用的影響時，主動脈環用 KCl(30 mmol·L-1)預收縮，當血管收縮達到坪值后，實驗組分別加入賽庚啶(1 μmol·L-1)和哌唑嗪(1 μmol·L-1)，對照組加入溶劑，待各組再次反應達到坪值后，實驗組分別累積加入 DLX(3 ～100 μmol·L-1)。

1.2.6DLX對血管平滑肌鈣內流和鈣釋放的影響血管穩定后，加入 NE(1 μmol·L-1)，收縮達坪值后洗脫，平衡1 h，然后用無鈣生理鹽溶液 (含EGTA 0.5 mmol· L-1)沖洗3次，DLX組中加入DLX(100 μmol·L-1)預孵 20 min，然后加入 NE(1 μmol·L-1)，可見血管出現短暫的收縮，待其恢復平穩以后，加入CaCl2(2.5 mmol·L-1)，可見血管再次收縮。對照組中加入溶劑預孵。記錄相應血管張力并計算變化值，以1 μmol·L-1NE誘發的最大收縮幅度為100%，比較兩組中NE與CaCl2最大收縮百分比的變化值。

1.3結果表示及統計分析以加入1 μmol·L-1NE或30 mmol·L-1KCl誘發的血管環的最大收縮幅度為100%，計算加入不同濃度DLX后張力變化百分比。實驗結果均以±s表示。應用SPSS 16.0作統計分析，兩樣本t檢驗進行差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1DLX對內皮完整和去內皮主動脈環預收縮的影響DLX在(3～100 μmol·L-1)的濃度范圍內對內皮完整和去內皮的大鼠離體胸主動脈環均具有濃度依賴性舒張作用(P＜0.01)。DLX對內皮完整組與去內皮組血管之間的舒張差異無顯著性，KCl和NE預刺激內皮完整組和去內皮組最大舒張Emax分別為(-79.85±2.45)%、(-82.13±8.55)% 和(-85.71±2.92)%、(-80.53±9.04)%，說明DLX的血管舒張作用無內皮依賴性。見Fig 1。

Fig 1 Effect of duloxetine on the contraction induced by KCl(30 mmol·L －1，A)and NE(1 μmol· L －1，B)in isolated thoracic aortic rings with intact endothelium or without endothelium in rats(±s，n=6).＊＊P＜0.01 indicates significant differences of arterial rings intact endothelium or without endothelium from control.

2.2鉀離子通道阻斷劑對DLX舒張作用的影響在KCl(30 mmol·L-1)預收縮的血管環上，加入K+通道阻斷劑Gli、TEA、BaCl2和4-AP，對DLX舒血管作用無影響，Gli阻斷組 Emax=(-82.01±5.84)%、TEA阻斷組Emax=(-81.35±1.12)%、BaCl2阻斷組Emax=(-77.80±1.57)%、4-AP阻斷組Emax=(-81.48±2.94)%。鉀離子通道阻斷劑不能抑制其血管舒張作用，DLX舒張血管可能與鉀離子通道激活無關。見Fig 2。

Fig 2 Effects of Gli(10 μmol·L －1)，TEA(10 mmol· L －1)，BaCl2(1 mmol·L －1)，4-AP(1 mmol·L －1)on the relaxation induced by duloxetine in isolated thoracic aortic rings pre-contracted with KCl(30 mmol·L －1)(ˉx ± s，n=6)

2.35-HT2受體阻斷劑賽庚啶和α1受體阻斷劑哌唑嗪對鹽酸度洛西汀舒張作用的影響在KCl(30 mmol·L-1)預收縮血管環上，5-HT2受體阻斷劑賽庚啶組對DLX舒血管作用無影響，其Emax=(-75.05±2.90)%。α1受體阻斷劑哌唑嗪組對DLX舒血管作用有抑制作用，其 Emax=(-55.98±3.10)%(P＜0.01)。見Fig 3。

2.4DLX對血管平滑肌外鈣內流和內鈣釋放的影響在無鈣的生理鹽溶液中，分別加入DLX(100 μmol· L-1)及溶液預孵20 min，加入 NE(1 μmol·L-1)，血管發生短暫的收縮，DLX組和溶劑對照組NE的收縮百分比分別為(6.88±1.26)、(24.09±4.17)，兩者比較有統計學意義(P＜0.01)，見Fig 4。血管恢復平穩以后，加入 CaCl2(2.5 mmol·L-1)，DLX組和溶劑對照組CaCl2的收縮百分比分別為(15.29±2.22)、(89.00±2.34)，兩者比較有統計學意義(P＜0.01)，見Fig 5。

3 討論

NE作用于血管平滑肌上的α1腎上腺素受體，受體操縱性鈣通道(receptor operated calcium channel，ROC)［4］開放，細胞外 Ca2+內流，同時激活磷脂酶C，引起膜磷脂酰肌醇水解，產生三磷酸肌醇，作用于肌漿網的三磷酸肌醇受體，促使肌漿網內Ca2+釋放［5］;高鉀引起血管平滑肌細胞膜去極化而刺激電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channel，VDC)開放，從而促使細胞外液中或與細胞膜疏松結合的Ca2+內流［6］。二者均通過細胞內游離鈣濃度的增加而產生血管收縮。本實驗觀察到，DLX對NE或KCl預收縮的血管環具有直接舒張作用，表明DLX舒張血管可能與細胞膜上VDC和ROC通道有關。內皮完整與去內皮血管相比，其舒張作用沒有差異，表明DLX所致的血管舒張與內皮無關。

Fig 3 Effects of cyproheptadine(1 μmol·L －1，A)and prazosin(1 μmol·L －1，B)on the relaxation induced by duloxetine in isolated thoracic aortic rings pre-contracted with KCl(30 mmol·L －1)(±s，n=6).*P＜0.05，＊＊P＜0.01

Fig 4 Effect of duloxetine on the NE-induced(1 μmol·L －1)contraction of rat thoracic aortic rings in free-Ca2+PSS(±s，n=6).

Fig 5 Effect of duloxetine on the NE-induced(1 μmol·L －1)contraction of rat thoracic aortic rings with CaCl22.5 mmol·L－1(±s，n=6).＊＊P ＜ 0.01 indicates significant differences of arterial rings pretreated with duloxetine from control

本實驗觀察到 KATP阻斷劑 Gli、BKCa阻斷劑TEA、Kir阻斷劑 BaCl2和Kv阻斷劑4-AP均不能抑制DLX的舒張血管作用，推測DLX舒張血管作用與鉀通道無關。

其次觀察到5-HT2受體阻斷劑賽庚啶不能抑制DLX的舒張血管作用，推測DLX舒張血管作用與拮抗5-HT2受體無關。血管平滑肌上的α1腎上腺素受體被激活時，通過觸發細胞內儲存的Ca2+釋放和細胞外Ca2+內流引起胞質游離Ca2+濃度升高［7］，從而引起平滑肌收縮。本實驗觀察到選擇性的α1受體阻斷劑哌唑嗪能部分抑制DLX的舒張血管作用，表明DLX舒張血管作用與拮抗α1受體有關。

在無鈣的生理鹽溶液中，加入NE可以引起血管短暫而快速的收縮，其收縮作用是內鈣釋放的結果［8］。隨后在浴液中加入CaCl2后，血管再次收縮達峰值，其收縮作用是外鈣內流的結果［9］。實驗結果顯示，提前用DLX預孵后，NE收縮血管的幅度明顯降低，加入CaCl2后再次收縮達峰值的幅度也明顯降低，進一步證明DLX是通過抑制外鈣內流來舒張血管，同時也通過抑制內鈣釋放來舒張血管。

綜上，DLX對KCl或NE預刺激的血管環的舒張作用可能是通過抑制經由血管平滑肌細胞膜VDC和ROC通道的鈣離子內流，拮抗α1受體以及抑制胞質內鈣離子釋放而發揮作用的。DLX的這種對離體血管的直接舒張作用，是否與臨床報道的DLX的心血管反應有關，其詳細機制還有待進一步深入探討。

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