蛇床子素對腦缺血/再灌注大鼠海馬LTP及氨基酸含量的影響

董曉華，張丹參，張 力，李 煒

(1.河北醫科大學藥學院，河北石家莊 050017;2.河北北方學院醫學院藥理學教研室，河北張家口 075000)

急性腦缺血可引起腦細胞損傷及嚴重的神經功能障礙，而恢復血流后，又可導致腦缺血/再灌注損傷，進一步產生一系列病理生理和生化的改變，并導致學習記憶障礙。蛇床子素(osthole，Ost)又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，是從傘形科蛇床屬植物蛇床的果實中提取的一種香豆素。具有抗炎、擴張血管、改善學習記憶、抗凝血、抑制血栓形成、調血脂和植物雌激素樣作用［1］。另有報道Ost可通過抑制炎癥反應及神經細胞凋亡對抗腦缺血/再灌注損傷［2］，但從突觸傳遞活動及中樞Glu/GABA系統探討Ost對腦缺血/再灌注損傷中學習記憶障礙影響的作用機制未見報道。本實驗采用TTC染色法、Morris水迷宮法、在體細胞外記錄麻醉大鼠海馬齒狀回突觸傳遞活動的電生理學方法及高效液相色譜法，觀察Ost對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死體積、空間學習記憶障礙、海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)高頻刺激(high frequency stimulation，HFS)誘導的長時程增強(long-term potentiation，LTP)現象及海馬內谷氨酸(glutamic acid，Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)含量的影響。

1 材料

1.1藥品和試劑蛇床子素，南京澤朗醫藥科技有限公司，實驗前用N，N二甲基甲酰胺溶解，吐溫80助溶(N，N二甲基甲酰胺 ∶吐溫80∶生理鹽水=1∶1∶8)，使用前用生理鹽水稀釋至所需濃度;栓線，北京沙東生物技術有限公司，產品編號2432-100;谷氨酸、γ-氨基丁酸標準品由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2儀器VC-11記憶示波器(日本Nihon Konden)，SEN-7203三道電子刺激器(日本 Nihon Konden)，SS-202J刺激隔離器(日本 Nihon Konden)，江灣Ⅰ型-C腦立體定位儀，LTP生物信號采集處理系統2003，Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所)，高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.3動物SD(Sprague-Dawley)大鼠，♂，216只，體質量180 g～200 g，購自中國醫學科學院動物繁育廠。

2 方法

2.1分組與給藥動物隨機分6組，每組36只，分別是正常組(Normal group)、假手術組(Sham-operated group)、模型組(Model group)、蛇床子素25.0mg·kg-1組(Ost A group)、蛇床子素12.5 mg·kg-1組(Ost B group)、尼莫地平 1.0 mg·kg-1組(Nim group)。各組均每天早晨腹腔注射(peritoneal injection，ip)給藥1次，連續給藥14d，正常組、假手術組、模型組給予等量的溶劑。

2.2動物模型制作d 6給藥30 min后采用改進Longa線栓法［3］制備大鼠大腦中動脈腦缺血/再灌注模型。10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于恒溫手術臺上，于頸部行15 mm旁正中縱行切口，鈍性分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)及頸外動脈(external carotid artery，ECA)。在ECA靠近頸內、外分叉約5 mm處剪一小切口，迅速將栓線(線長40 mm，線身直徑0.24 mm，頭端直徑0.32 mm±0.02 mm)從ECA經過ICA插入大腦中動脈開口處前端(平均插入約20 mm±0.5 mm)，直到有輕微阻力感為止。2 h后提拉栓線直至退回ECA內，實現大腦中動脈再灌注。正常對照組不進行手術，假手術組將栓線送入ICA，但不入顱。

2.3腦梗死體積的測定再灌注后24 h進行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，按照文獻方法［4］快速斷頭取腦，置冰箱(-20℃)內10 min達到適當硬度，切除嗅腦、小腦和低位腦干后，取冠狀面從前向后連續等距離切取5個腦片，將腦片放于2%TTC染液37℃孵育30 min，4%多聚甲醛避光固定24 h。未受損的正常腦組織染色后呈紅色，梗死組織不著色而呈白色，將白色組織仔細分離并稱重，按以下公式計算腦梗死體積:腦梗死體積百分比/%=缺血部分重量/全腦重量×100%。

2.4Morris水迷宮實驗再灌注后d 4開始進行水迷宮實驗，每只動物連續訓練4 d，每天訓練2次，間隔15 min，每次所采用的入池位置為站臺所對及相鄰象限，每次訓練3 min。動物找到并爬到站臺后讓其停留20 s，若入水后3 min內未能找到或爬上站臺，則將其放置于站臺上站立20 s，之后將動物從站臺上取下休息，結果以大鼠尋找站臺的時間即潛伏期表示。

2.5電生理學實驗再灌注后d 8行電生理學實驗，參照Pellegrino大鼠腦立體定位圖譜中的定位方法，定位刺激電極和記錄電極。誘發電位和HFS參數按照文獻方法［5］。給予HFS后，如果群峰電位(PS)幅度較自身對照值增加30%以上且持續時間超過30 min，則表明LTP現象已形成。

2.6氨基酸含量測定分別于再灌后1、6、24、72 h斷頭取腦，冰盤中分離缺血側海馬，加入9倍體積的甲醇/水(V/V=1∶1)制成10%腦組織勻漿，以10 000r·min-1低溫高速離心 10 min，留取上清-80℃保存。采用柱前衍生化高效液相色譜紫外檢測法測定，取腦組織勻漿液 200 μl，加入 200 μl乙腈，混勻，低溫高速離心除蛋白10 min(10 000 r·min-1)，取上清液加入 200 μl 0.5 mol·L-1碳酸氫鈉和100 μl 0.5%2 ，4-二硝基氟苯，混勻，暗中衍生 1 h，水浴 60 ℃，進樣 20 μl。

2.7統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件，所有數據均以±s表示，組間比較采用t檢驗。

3 結果

3.1蛇床子素對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死體積的影響正常組和假手術組未發現梗死灶，模型組梗死體積是43% ±11%，與假手術組比較明顯增大(P＜0.01)，而蛇床子素 25.0 mg·kg-1組、12.5 mg·kg-1組及尼莫地平組與模型組相比梗死體積明顯縮小，結果見 Fig 1A，1B。

3.2蛇床子素對腦缺血/再灌注大鼠Morris水迷宮實驗潛伏期的影響如Tab 1所示，隨著訓練天數的增加，各實驗組潛伏期均不斷縮短;實驗d 1各組間潛伏期相比差異無顯著性(P＞0.05);模型組與假手術組相比，訓練d 2開始，潛伏期延長(P＜0.05)，到d 4差異有顯著性(P＜0.01);蛇床子素25.0 mg·kg-1組與模型組相比，從d 2開始，潛伏期明顯縮短 (P＜0.05)，d 3～d 4有顯著性差異(P＜0.01);蛇床子素12.5 mg·kg-1組與模型組相比d 4潛伏期明顯縮短 (P＜0.05);尼莫地平組與模型組相比，潛伏期從d 3開始縮短(P＜0.05);假手術組與正常組比較無差異，說明單純手術操作對大鼠Morris水迷宮結果無影響。

Tab 1 Effects of osthole on the latency in Morris water maze test in cerebral ischemia-reperfusion rats(xˉ±s，n=6)

3.3蛇床子素對腦缺血/再灌注大鼠海馬DG HFS誘導LTP的影響結果見Fig 2，各組在給予HFS后，群峰電位(population spike，PS)幅值明顯增大并維持，在觀察的60 min內無明顯減弱;模型組在HFS后PS幅值增加，但各時間點與假手術組相比，PS幅值增加幅度減少(P＜0.05);蛇床子素A組(25.0 mg·kg-1)在HFS后，10 min時PS幅值即開始升高，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.01)，30 min開始與模型組相比P＜0.05;蛇床子素 B組(12.5 mg·kg-1)在HFS后，10 min時PS幅值即開始升高，與模型組相比升高(P＜0.05);尼莫地平組與模型組比較PS幅值明顯升高;假手術組與正常組相比PS幅值無差異，說明手術操作對大鼠LTP無影響，結果見Fig 2。

Fig 1 Effects of osthole on the infarct volume in cerebral ischemiareperfusion rats(±s，n=6)

Fig 2 Effects of osthole on LTP induced by HFS in the DG of hippocampus in cerebral ischemia-reperfusion rats(±s，n=6)

3.4蛇床子素對腦缺血/再灌注大鼠海馬氨基酸含量的影響

3.4.1蛇床子素對腦缺血/再灌注大鼠海馬Glu含量的影響由Tab 2可以看出，與假手術組相比，模型組海馬 Glu含量再灌注24 h內，均升高(P＜0.05)，于72 h恢復正常;與模型組相比，蛇床子素25.0 mg·kg-1組Glu含量在各個時間點降低(P＜0.05)，蛇床子素12.5 mg·kg-1組在再灌注1 h，6 h Glu含量均降低 (P＜0.05)，72 h基本恢復正常;尼莫地平組與模型組相比各時間點Glu含量明顯降低;假手術組與正常組比較無差異，說明手術操作對海馬Glu含量無影響。

Tab 2 Effects of osthole on the contents of Glu in hippocampus of cerebral ischemia-reperfusion rats(xˉ±s，n=6)

3.4.2蛇床子素對腦缺血/再灌注大鼠海馬GABA含量的影響由Tab 3可以看出，與假手術組相比，再灌注后24 h內模型組GABA含量升高(P＜0.05)，72 h基本恢復正常;與模型組相比，蛇床子素25.0 mg·kg-1組再灌后1 h海馬GABA含量降低(P＜0.05)，72 h升高(P＜0.05);蛇床子素12.5 mg·kg-1組與模型組相比再灌注1 h海馬GABA含量下降(P＜0.05);尼莫地平組與模型組相比1 h和6 h降低(P＜0.01)，72升高(P＜0.05);假手術組與正常組比較無差異，說明手術操作對海馬GABA含量無影響。

Tab 3 Effects of osthole on the contents of GABA in hippocampus of cerebral ischemia-reperfusion rats(ˉx ± s，n=6)

4 討論

本實驗利用大鼠大腦中動脈栓塞模型，模擬臨床上局部腦缺血/再灌注過程，發現在缺血前5 d給予蛇床子素后，可明顯縮小大鼠腦缺血的梗死體積，說明蛇床子素對腦缺血/再灌注損傷具有神經保護作用。在Morris水迷宮實驗中觀察到蛇床子素可明顯縮短尋找站臺的潛伏期，改善缺血/再灌注大鼠空間學習記憶障礙。海馬是學習記憶過程中起關鍵作用的中樞結構，LTP是海馬突觸可塑性的重要形式，是學習記憶的神經細胞學基礎［6］，因此我們利用電生理學實驗觀察蛇床子素對LTP的影響，結果表明蛇床子素(25.0、12.5mg·kg-1)對腦缺血/再灌注大鼠海馬齒狀回HFS誘導的LTP有增強作用，且在觀察的60 min內無明顯減弱，這與其促進學習記憶的行為學實驗結果一致，即從整體和細胞水平證實蛇床子素對腦缺血/再灌注損傷引起的學習記憶障礙有改善作用。

本實驗對缺血/再灌注后不同時間點海馬內Glu和GABA水平進行了比較分析，結果顯示模型組大鼠兩種氨基酸的變化時相基本一致，再灌注后水平開始升高，在1 h時最高，持續24 h，然后逐漸下降，再灌注72 h時基本恢復正常;蛇床子素可以降低缺血/再灌注后72 h內谷氨酸含量，而對于GABA含量蛇床子素25.0 mg·kg-1呈現一種先降低后升高的趨勢，且在同一時間點隨著蛇床子素劑量的增加GABA降低幅度越小，如蛇床子素25.0 mg·kg-1組和12.5 mg·kg-1組在6 h時分別降低13%和18%，24 h分別降低15%和20%，表明蛇床子素(25.0 mg·kg-1)可通過降低Glu含量、提高GABA的含量，影響中樞Glu/GABA學習記憶調節系統。中樞Glu/GABA學習記憶調節系統是繼膽堿能神經之后神經遞質調控學習功能的一種新理論。在腦缺血損傷后，Glu大量釋放激活NMDA受體，引起細胞內Ca2+超載，并最終引起神經細胞代謝和功能障礙及死亡［7］，同時可造成海馬區域內病理性的LTP及以后的信息傳遞障礙，形成學習記憶缺陷［8］。而GABA可通過突觸后膜超極化，減少Ca2+內流，突觸前抑制降低Glu釋放，從而對抗Glu興奮性毒性作用［9］。我們的研究表明蛇床子素可減弱缺血/再灌注后Glu誘導的病理級聯反應并通過升高GABA含量對抗Glu引起的興奮性毒性，發揮腦保護作用。這可能是其改善大鼠學習記憶障礙，增強海馬LTP，發揮缺血/再灌注損傷保護作用的機制之一。

祖國傳統醫藥在治療缺血性腦血管病方面有較大潛力，越來越多的植物藥在腦缺血/再灌注損傷中作用得到研究和應用。蛇床子素作為有效成分之一在心血管系統、中樞神經系統、免疫系統廣泛應用，其毒副作用較小。研究表明蛇床子素通過抗炎和抗氧化機制而抗腦缺血損傷［2］，我們的實驗進一步證實蛇床子素調節中樞Glu/GABA系統而具有改善腦缺血/再灌注后的學習記憶障礙作用，因此蛇床子素在對腦缺血/再灌注損傷的防治作用將是多靶點、多層次、多方位的，較其他植物藥更具有潛力和優勢。另外蛇床子素具有腦組織靶向性，透過血-腦屏障［10］，這為其治療缺血性腦血管病奠定藥動學基礎。總之，對蛇床子素在腦缺血/再灌注損傷中作用的進一步研究，在老齡化社會的今天，具有廣闊的前景和實用價值。

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