葛根素對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用及機(jī)制研究

陳 放，劉開揚，徐 珊，呂偉紅，程 宏，張洪泉

(揚州大學(xué)1.臨床醫(yī)學(xué)院眼科，2.醫(yī)藥研究所，3.醫(yī)學(xué)院生化教研室，江蘇揚州 225001)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，已成為目前世界范圍內(nèi)致盲的主要眼病。由于病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前DR治療效果不盡如人意。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)被認(rèn)為在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生中起重要作用［1-2］。慢性高血糖引起機(jī)體蛋白質(zhì)非酶糖化所形成的AGEs在視網(wǎng)膜組織內(nèi)大量堆積［3］，通過作用于細(xì)胞上的特異性AGEs受體(RAGE)，激活多個信號傳導(dǎo)通路，最終引起DR。因此，抑制AGEs形成或阻斷AGE與其受體相互作用可能延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展［4］。葛根素(puerarin，Pue)為葛根干燥根中提取得到的一種單體異黃酮類有效成分，化學(xué)名為 8-β-D 吡喃葡萄糖-4'，7'-二羥基異黃酮苷，其分子式為C21H20O9。葛根素具有擴(kuò)張冠狀動脈、降血脂、降血糖、改善微循環(huán)等藥理作用，現(xiàn)已廣泛用于治療心血管疾病、糖尿病等。體外實驗已表明，葛根素具有抑制蛋白非酶糖基化的作用，且葛根素在抑制AGEs產(chǎn)生的同時減少AGEs對牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的損傷［5］。Shen等［6］觀察到葛根素對糖尿病大鼠腎臟、主動脈AGEs和RAGE的水平有明顯的抑制作用。但有關(guān)葛根素對視網(wǎng)膜AGEs的影響未見報道。本實驗以STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，從抑制蛋白非酶糖基化途徑探討葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物♂40只清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，鼠齡為8～10周，體質(zhì)量200～230 g，眼部檢查無異常，由浙江省實驗動物中心提供。

1.2試劑與儀器葛根素(puerarin，純度 ＞99.8%)由南京正大天晴制藥公司提供;鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購于 Sigma公司;兔抗大鼠RAGE抗體、兔抗VEGF抗體均購于Cell Signalling公司;羥脯氨酸檢測試劑盒購于南京建成生物公司;手術(shù)顯微鏡(SM-2000J):蘇州六六視覺醫(yī)療設(shè)備有限公司;RT-PCR儀:Bio-Rad公司;熒光分光光度計:北京萬拓公司。

1.3方法

1.3.1DM大鼠模型的復(fù)制與分組隨機(jī)分為正常對照(Control)組(10只)和DM制模組(30只)。參照文獻(xiàn)方法［7］，DM 制模組每鼠左下腹腔注射STZ 60 mg·kg-1。72 h后取鼠尾血測血糖，并用尿糖試紙測尿糖。隨機(jī)血糖濃度≥16.65 mmol·L-1，尿糖在?～?者即為成模大鼠。然后將成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照(DM)組、DM+葛根素低劑量組(Pue1組)、DM+葛根素高劑量組(Pue2組)，每組10只。葛根素低、高劑量組分別應(yīng)用葛根素250、500 mg·kg-1治療［7］，每日 1 次，采用經(jīng)食道灌胃給藥，Control組、DM組不予任何藥物治療，每日每只灌3ml滅菌水。自造模成功起，連續(xù)給藥4周。實驗期間自由進(jìn)水、進(jìn)食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.3.2標(biāo)本收集實驗期間，各組大鼠每周測1次體重、血糖，觀察大鼠全身一般情況及眼部情況。給藥4周后，1%戊巴比妥鈉(0.4 mg·kg-1)大鼠腹腔注射麻醉。小心、迅速摘除雙眼眼球。取好標(biāo)本后，過量麻醉處死動物。一眼眼球置于固定液中，用于光學(xué)顯微鏡檢查;另一眼于存有生理鹽水的玻璃皿中去除眼前節(jié)及玻璃體，在手術(shù)顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜組織，用于測定AGEs含量或-80℃儲存以待分子生物學(xué)檢測。

1.3.3組織病理學(xué)觀察眼球摘取后迅速置入10%中性福爾馬林固定液中，24 h后作經(jīng)視盤的矢狀切片，梯度濃度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(片厚5 μm)、蘇木精素和伊紅染色、光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.3.4視網(wǎng)膜AGEs測定用熒光法測定AGEs的含量［8］。將視網(wǎng)膜組織加 PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.4)4 ml，以超聲波勻漿器勻漿60 s，于4℃離心，6 000 r·min-1×30 min。沉淀物用去離子水洗3次，然后加氯仿-甲醇(2∶1)5 ml，4℃振蕩過夜。再加入2 ml甲醇及0.5 ml水，離心，沉淀物再用甲醇洗3次，去離子水洗 3次(水化、沖洗)。再用HEPES緩沖液(pH 7.5，0.1 mmol·L-1CaCl2)洗2次，沉淀物于5 ml緩沖液中，4℃過夜。離心去緩沖液，將沉淀物懸浮于1.0 ml包含Ⅴ型膠原酶(290 U)的HEPES緩沖液中，加入防腐劑(甲苯、氯仿各2 μl)。以含HEPES緩沖液及膠原酶作為空白標(biāo)準(zhǔn)管，37℃振蕩消化 24 h。離心3 000 r·min-1×3 min，留取上清消化液，于消化液中加蒸餾水1 ml，避光靜置1 h。用熒光分光光度計在370/440 nm(發(fā)射波長/激發(fā)波長)處測定其熒光強(qiáng)度。消化液中羥脯氨酸含量用氯胺T法測定。AGEs含量以每mg羥脯氨酸所含的熒光強(qiáng)度為一個任意單位(Arbitrary Unit)，用AU表示。

1.3.5Real Time PCR檢測大鼠視網(wǎng)膜組織加Trizol 0.5 ml用電動勻漿器冰上充分勻漿，室溫放置5 min，使其充分裂解。從大鼠視網(wǎng)膜組織中分離出RNA合成cDNA。運用PCR分析RAGE、VEGF基因表達(dá)水平。大鼠特異的引物如下:RAGE(sense)，5'AGGCTCTGTGGATGGGTCTGG3';RAGE(antisense)，5'CATGGATCATGTGGGCTCTGG3';VEGF(sense)，5'GTGGACATCTTCCAGGAGGAGTA3';VEGF(antisense)，5'CTCTGAACAAGGCTCACAGT3'。所有反應(yīng)都按照操作程序進(jìn)行，反應(yīng)條件是:50℃ 2 min，95℃ 10 min，然后95℃ 15 s、60℃ 1 min，循環(huán)40次。每一樣品試驗3次，結(jié)果取平均值。β-actin作為參照，其引物序列為(sense)5'-GCACCGCAAATGCTTCTA-3';(antisense)5'-GGT CTTTACGGATGTCAACG-3'。最終結(jié)果計為與對照組進(jìn)行比較后的相對值，對照組設(shè)置為1。

1.3.6Western blot檢測取視網(wǎng)膜組織，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑(百泰克公司)，提取蛋白質(zhì);檢測蛋白質(zhì)濃度，各樣本稀釋成統(tǒng)一濃度，進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳;電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用含5%脫脂牛奶的 TBST(0.05%Tween-20)封閉1 h，然后分別用抗RAGE抗體(1∶1 000稀釋，Cell Signaling公司)、抗 VEGF抗體(1∶1 000稀釋，Cell Signaling公司)及抗 β-actin抗體(內(nèi)參，1∶3 000稀釋，Santa Cruz公司)4℃孵育過夜;洗膜后用1∶5 000稀釋的二抗(偶聯(lián)有HRP，博士德公司)室溫孵育2 h，洗膜后，將膜浸沒于配置好的ECL超敏感光混合液(普利萊公司)，計時3 min，暗室中采用X線片壓膜發(fā)光;經(jīng)顯影及定影獲得結(jié)果，并采用Bio-Rad公司Quantity one軟件分析結(jié)果。

1.3.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況實驗期間正常對照組大鼠行動活躍，飲食正常，毛色光滑，無多飲、多食、多尿現(xiàn)象，體重增長明顯。DM組大鼠出現(xiàn)行動緩慢、毛色灰暗，多飲、多食、多尿與體重減輕。Pue1、Pue2組大鼠“三多一少”癥狀有所緩解。Pue治療組大鼠空腹血糖較治療前及DM組均明顯降低(P＜0.05)，其中Pue2組降低血糖作用較強(qiáng)(P＜0.01)，但仍高于正常對照組(P＜0.05)。說明葛根素尤其是高劑量組具有一定降低血糖的作用，但尚不能使血糖恢復(fù)到正常大鼠的水平(Tab 1)。

2.2視網(wǎng)膜組織學(xué)改變給藥后4周，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞層次分明，細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密。DM組大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜厚度明顯變薄，尤其是外核層，其厚度明顯薄于正常對照組。Pue治療后較DM組有所好轉(zhuǎn)，尤其高劑量Pue組外核層細(xì)胞厚度比DM組明顯增厚，但較正常對照組仍薄(Fig 1)。

Tab 1 Influence of puerarin on fasting blood glucose in diabetic rats induced by streptozotocin(mmol·L-1，±s，n=10)

Tab 1 Influence of puerarin on fasting blood glucose in diabetic rats induced by streptozotocin(mmol·L-1，±s，n=10)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM

Group 0 wk 1 wk 2 wk 3 wk 4 wk Control 4.98±0.37 4.62±0.13 5.12±0.44 5.23±0.42 6.32±0.50 DM 29.52±3.14* 29.92±2.70* 30.25±2.86* 30.03±3.90* 29.97±2.27*Pue1 28.63±3.35 27.39±2.81*# 29.02±5.36* 27.20±3.67*# 25.85±3.35*#Pue2 28.46±3.02 27.9±1.57*# 25.11±1.79*# 25.69±2.03*## 23.51±2.31*##

Fig 1 Influence of puerarin on histopathologic changes of retina in rats on 4th week

2.3視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，給藥4周時，DM組大鼠視網(wǎng)膜中VEGF的mRNA表達(dá)水平即明顯高于正常對照組(P＜0.01);Pue1、Pue2組VEGF的mRNA表達(dá)水平均明顯下降，與DM組相比差異有顯著性(P＜0.01)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(Fig 2)。Western blot檢測結(jié)果顯示，VEGF的蛋白表達(dá)在正常對照組視網(wǎng)膜組織中表達(dá)較低。DM組視網(wǎng)膜組織中VEGF的蛋白表達(dá)明顯高于正常對照組 (P＜0.05)。而不同劑量葛根素干預(yù)后表達(dá)均明顯下降，與DM組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，接近于正常對照組(P＞0.05)(Fig 3)。

2.4視網(wǎng)膜內(nèi)AGEs含量造模4周的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)AGEs水平(9.38±0.41)AU·mg-1Pro，較正常對照組(3.08±0.42)AU·mg-1·Pro明顯上調(diào)(P＜0.05)。低劑量葛根素對AGEs的形成影響不大(7.67±0.38)AU·mg-1Pro。高劑量葛根素干預(yù)能抑制AGEs形成(6.62±0.51)AU·mg-1Pro，與DM組相比差異有顯著性(P＜0.05)，但與正常對照組相比仍偏高(P＜0.05)。

Fig 2 VEGF mRNAs quantified by using RT-PCR

Fig 3 Representative Western blot analysis of VEGF expression in rat retina

2.5視網(wǎng)膜RAGE表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，DM組中RAGE的mRNA表達(dá)水平高于正常對照組(P＜0.01)。低劑量葛根素組RAGE的mRNA表達(dá)水平下降不明顯，與DM組相比差異無顯著性(P＞0.05)。高劑量葛根素干預(yù)組RAGE的mRNA表達(dá)水平明顯下降，與DM組相比差異有顯著性(P＜0.01)，與正常對照組無明顯差異(P＞0.05)(Fig 4)。Western blot檢測結(jié)果顯示，RAGE蛋白表達(dá)在正常對照組視網(wǎng)膜組織中較低。DM組視網(wǎng)膜組織中表達(dá)明顯高于正常對照組 (P＜0.05)。低劑量葛根素組RAGE的蛋白表達(dá)水平下降亦不明顯，與DM組相比無差異(P＞0.05)。高劑量葛根素干預(yù)組RAGE蛋白表達(dá)明顯下降，低于 DM組(P＜0.05)，接近于正常對照組(P＞0.05)(Fig 5)。

3 討論

本研究中STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠發(fā)病4周時，出現(xiàn)了視網(wǎng)膜尤其是外核層厚度的變化，這與其他學(xué)者的報道是一致的［8］。高劑量葛根素干預(yù)后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度較DM組明顯增加。我們首先從形態(tài)學(xué)證實了全身使用葛根素對早期糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的確有保護(hù)作用，可延緩糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的出現(xiàn)。

大量的研究已表明VEGF在DR的發(fā)生發(fā)展中扮演非常重要的角色，并且可能參與DR發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)。在正常視網(wǎng)膜組織中VEGF表達(dá)很低，在糖尿病時視網(wǎng)膜組織中VEGF表達(dá)增高，導(dǎo)致一系列的反應(yīng)，包括視網(wǎng)膜血管滲漏、刺激視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)新生血管形成，引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前VEGF水平被作為判斷DR發(fā)展嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)，亦是防治DR的重要靶點，抑制VEGF的產(chǎn)生可以延緩DR病變的發(fā)生發(fā)展［9］。本研究中造模后4周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的VEGF mRNA和蛋白水平均已明顯升高，不同劑量葛根素干預(yù)后其表達(dá)水平均明顯降低，再次提示葛根素對糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜具有一定的保護(hù)作用。

Fig 4 RAGE mRNAs quantified by using RT-PCR

Fig 5 Representative Western blot analysis of RAGE expression in rat retina

本研究結(jié)果顯示，葛根素雖然有一定降血糖的作用，但其降血糖作用是有限的，即使是高劑量的葛根素亦不能使血糖降至正常水平，但它可使視網(wǎng)膜VEGF水平基本降至正常。這提示我們葛根素對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用可能與其降低血糖的作用不直接相關(guān)，而是通過其他機(jī)制來抑制VEGF表達(dá)。

體內(nèi)外實驗已表明，葛根素具有抑制蛋白非酶糖化的作用，而晚期糖基化終末化產(chǎn)物(AGEs)已被認(rèn)為與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生密切相關(guān)。AGEs特異性受體(RAGE)屬免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面分子，在許多細(xì)胞表面都低水平表達(dá)，可結(jié)合并內(nèi)吞AGEs使其降解。在糖尿病、氧化應(yīng)激等病理條件下，RAGE表達(dá)可明顯增高［3］。本研究顯示造模4周時，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中AGEs含量明顯高于正常對照組，RAGE表達(dá)亦明顯增高，證實了AGEs及其受體在DR發(fā)生、發(fā)展過程中具有一定作用。高劑量葛根素干預(yù)后，可抑制視網(wǎng)膜 AGEs形成，RAGE表達(dá)較糖尿病組亦明顯減少。本研究首次報道了葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AGE-RAGE的抑制。葛根素阻斷機(jī)體內(nèi)蛋白糖基化的可能途徑:一是有效降低血糖濃度，二是特異性阻斷AGE-RAGE的結(jié)合。高血糖是引起蛋白非酶糖化的直接因素，并且蛋白非酶糖化的程度隨著血糖的升高而加重。降低血糖最直接的效應(yīng)是減少早期蛋白非酶糖基化產(chǎn)物的形成，從而阻止AGEs的產(chǎn)生，并抑制其與受體的相互作用。本實驗結(jié)果顯示葛根素可降低糖尿病大鼠的血糖，又可阻止蛋白糖基化的進(jìn)程，減少AGEs的形成，下調(diào)RAGE過度表達(dá)，提示葛根素可能通過抑制視網(wǎng)膜AGE-RAGE途徑來減輕早期糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜病變。

AGEs在體內(nèi)導(dǎo)致DR發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚。許多證據(jù)證明RAGE是AGEs的特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，它和AGEs配對激活血管炎癥反應(yīng)和相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展［10］。目前研究認(rèn)為，AGEs與其受體RAGE結(jié)合后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，生成大量氧自由基，激活p21ras/MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)，進(jìn)而激活多種炎癥相關(guān)基因的調(diào)控樞紐轉(zhuǎn)錄因子核因子NF-κB，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜周細(xì)胞的凋亡、增加白細(xì)胞黏附、聚集及活化、促進(jìn) VEGF的表達(dá)等［11］。有學(xué)者［12］發(fā)現(xiàn) AGE可使 VEGF mRNA的表達(dá)明顯增加，且增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)患者玻璃體VEGF和AGE含量均明顯高于非糖尿病患者，VEGF與AGE呈正相關(guān)。AGE通過增加VEGF的產(chǎn)生而參與DR的發(fā)生發(fā)展。在我們之前的研究中已證實葛根素可抑制DM大鼠視網(wǎng)膜NF-κB的活化［13］，這提示我們葛根素可能通過抑制AGEs形成和RAGE的表達(dá)，從而抑制NF-κB的激活，阻斷了NF-κB所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的反應(yīng)鏈，間接抑制了視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)，起到保護(hù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的作用。具體的信號傳導(dǎo)通路有待于進(jìn)一步的研究。

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